海南省自然科学基金(808230)
- 作品数：3 被引量：4H指数：2
- 相关作者：王淑荣陈志斌孙圣刚陈小武王埮更多>>
- 相关机构：华中科技大学海南医学院附属医院更多>>
- 发文基金：海南省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人14-3-3 γ基因的腺病毒载体的构建及其在PC12细胞中的表达被引量：4
- 2011年
- 目的:构建携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒表达载体并确定其对PC12细胞的感染效率。方法:采用PCR方法,从Top10/pHis-14-3-3γ质粒中扩增14-3-3γDNA序列,将14-3-3γ基因定向克隆到穿梭质粒载体pAdTrack-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1载体同源重组后得到携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒(pAd/14-3-3γ),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外感染PC12细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western Blot检测14-3-3γ蛋白的表达。结果:克隆得到人14-3-3γ基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染PC12细胞。结论:本实验成功构建了表达14-3-3γ的复制缺陷型重组腺病毒Ad-14-3-3,为用14-3-3γ基因治疗帕金森病奠定了基础。
- 陈小武陈志斌王埮袁昆雄王淑荣孙圣刚
- 关键词：腺病毒载体基因治疗PC12细胞
- 人14—3—3γ基因转移对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用被引量：2
- 2012年
- 目的探讨14-3—3γ转基因疗法对帕金森病模型大鼠的治疗作用及可能机制。方法用携带人14—3—3γ基因的重组腺病毒（Ad）感染帕金森病大鼠模型纹状体后，采用免疫组化方法检测纹状体与黑质酪氨酸羟化酶（TH）的表达、免疫印迹技术检测Caspase-3及14—3—3γ蛋白的表达、高效液相色谱法检测纹状体DA及其代谢产物DOPAc含量变化，并对PD大鼠的旋转行为进行评分。结果Ad／14—3—3γ注射PD大鼠纹状体后14—3—3γmRNA及蛋白均能过表达。Ad／14—3—3γ组黑质TH免疫反应阳性的细胞数和纹状体TH免疫反应阳性的神经纤维光密度值与正常对照侧的比值（0．47±0．12和0．61±0．14）显著高于PBS组（0．16±0．13和0．25±0．12）和LacZ组（0．15±0．09和0．27±0．11）（均P〈0．01）。Ad／1433γ组注射侧大鼠纹状体区DA含量与对侧比值为0．37±0．14，显著高于PBS组（0．15±0．08，P=0．006）和LacZ组（0．19±0．11，P=0．007）；其代谢产物DOPAC含量与对侧比值Ad／14—3—37组（0．34±0．12）也高于对照组（PBS组为0．13±0．10，LacZ组为0．16±0．09，均P=0．00）。Ad／14-3-3γ组注射侧纹状体中Caspase=3的表达与对侧相比显著降低。行为学评估结果显示Ad／14—3—3γ组大鼠平均旋转次数在第2次注射后的第1周、第2周和第6周均低于PBS组和LacZ组（均P〈0．01）；而PBS组和LacZ组相比，两组的旋转次数在上述三个时间点均差异无统计学意义（P=0．764，0．779和0．742）。结论14-3—3γ对PD模型大鼠的多巴胺能神经元有保护作用，是PD基因治疗中非常有前景的候选基因。
- 陈小武陈志斌王琰王淑荣蔡美华孙圣刚
- 关键词：基因疗法基因转移技术帕金森病
- 腺病毒载体介导的人14-3-3γ基因转移对鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞损伤的保护作用被引量：2
- 2012年
- 目的 探讨人14-3-3 γ基因转移对鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞损伤的保护作用.方法用腺病毒载体携带人14-3-3 γ基因（Ad/14-3-3 γ）感染PC12细胞,基因转移成功后,用鱼藤酮处理细胞.四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定细胞活性,DAP1染色法检测细胞凋亡,高效液相色谱检测细胞的分泌功能,激光共聚焦显微镜观察α-突触核蛋白（α-synuclein）的聚集.结果 Ad/14-3-3 γ组细胞吸光度A570 （0.46 ±0.09）,高于Ad-null组（0.19 ±0.08）和鱼藤酮组（0.16±0.07）,但低于正常对照组（0.63±0.11）,分别与各组比较,差异均有统计学意义（均P＜ 0.01）；Ad/14-3-3 γ感染组细胞培养液中多巴胺（ 189±11） ng/ml和去甲肾上腺素（55±8）ng/ml,含量高于Ad-null感染组（79±12,38±7）ng/ml和鱼藤酮组（81 ±13,39±7）ng/ml（均P＜ 0.01）；DAPI染色法显示Ad/14-3-3 γ组凋亡率（27％±6％）,高于正常对照组（10％±5％）,但明显低于Ad-null组（53％±10％）和鱼藤酮组（56％±12％）,分别与各组比较,差异均有统计学意义（均P＜ 0.01）；激光共聚焦显微镜下观察Ad/14-3-3 γ组细胞胞质内颗粒状α-synuclein聚集体较Ad-null组和鱼藤酮组显著减少.结论 腺病毒介导的14-3-3 γ基因转移对鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞损伤具有保护作用.
- 陈小武王埮袁昆雄王源江王淑荣孙圣刚陈志斌
- 关键词：腺病毒科细胞保护基因转移技术
