国家自然科学基金(30371255)
- 作品数：2 被引量：6H指数：1
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- 蚊抗药性相关糜蛋白酶基因的表达、纯化及活性分析
- 2006年
- 目的表达、纯化淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关糜蛋白酶（NYD-Ch）基因并进行酶活性分析。方法应用PCR和基因重组技术，构建原核表达载体，表达目的蛋白；用酶促底物法测定表达蛋白NYDCh的酶学活性和最适pH值。结果成功构建重组表达载体pET32a（＋）／NYD-Ch，并转化到感受态菌E．coli BL21（DE3）中。SDS-PAGE和Western blot显示，目的蛋白分子质量与理论值相符。NYD-Ch最大活力通过S（Ala）2ProPhe-pNA获得。NYD-Ch活力随pH的增高而增大，在pH8．01～11．0的范围内较高，pH10．0时达最高。抑制剂PMSF、SBTI、TPCK对NYD-Ch酶活力均有明显的抑制作用。结论成功表达了NYD-Ch蛋白，并分析了其酶学活性。本结果为深入研究NYD-Ch与杀虫剂抗性关系奠定基础。
- 孙艳马磊钱瑾孙静孙立新
- 关键词：糜蛋白酶原核表达纯化酶活性
- 淡色库蚊抗药性相关基因——NYD-MLC2基因的克隆与分析被引量：6
- 2006年
- 目的:获取淡色库蚊抗药性相关基因NYD-MLC2的cDNA全长序列并鉴定其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因片段序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增NYD-MLC2基因3′、5′端,经对位拼接获得全长序列,并进行生物信息学分析;荧光定量PCR验证此基因在抗性和敏感品系的表达差异。结果:获得淡色库蚊NYD-MLC2cDNA全长序列,开放阅读框为630bp(GenBank/NCBIDQ140391),编码210个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-MLC2与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)一个未知功能的蛋白同源性最高,为91%;实时荧光定量PCR结果显示,NYD-MLC2在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的4.08倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因cDNA全长序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-MLC2与淡色库蚊溴氰菊酯抗药性相关,值得进一步研究。
- 钱瑾孙静孙立新孙艳胡小邦马磊朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊抗药性RACE定量PCR
