国家重点基础研究发展计划(2012CB-114600)
- 作品数：11 被引量：26H指数：4
- 相关作者：夏庆友胡小元李轶女易咏竹张志芳更多>>
- 相关机构：西南大学中国农业科学院生物技术研究所江苏科技大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 家蚕Rab1基因的克隆及在裸蛹(Nd)突变品系幼虫丝腺中的表达分析被引量：1
- 2013年
- Rab1基因是大鼠肉瘤鸟苷三磷酸酶(Ras)基因家族的一员,调控囊泡从内质网到高尔基体的运输等重要细胞生理过程。通过生物信息学分析发现,家蚕Rab1(BmRab1)基因CDS长609 bp,含有5个外显子,编码202个氨基酸,位于第25染色体nscaf2823:1286217..1289996(+strand),与丝素重链基因(fib-H)相距200 kb左右。对正常结茧家蚕品系大造和无丝素分泌的裸蛹(Nd)突变品系的BmRab1的序列结构分析显示:大造和Nd品系的BmRab1 cDNA序列第543个碱基处存在单碱基突变,但翻译的氨基酸序列完全相同;在Nd品系中BmRab1的3'端非翻译区缺失8 bp。组织表达分析表明,BmRab1基因在Nd品系4眠和整个5龄期幼虫的后部丝腺异常高量表达,荧光定量PCR显示BmRab1在Nd品系5龄第3天幼虫后部丝腺的表达量是大造的3倍左右。进一步对Nd品系与大造的BmRab1上游启动子序列(-2 200 bp)及其内含子序列进行比较分析发现,Nd品系BmRab1启动子区域出现了2处缺失,并在第3内含子有81 bp插入,第4内含子453 bp替换了大造的263 bp。初步推测BmRab1可能参与了Nd品系幼虫后部丝腺退化萎缩的生理变化,但该基因是否是导致Nd品系后部丝腺退化萎缩的突变基因,还有待进一步证实。
- 胡文波刘春魏丽婉赵小明陈志伟李琼艳夏庆友
- 关键词：家蚕丝腺
- 基因组编辑开启家蚕研究新纪元被引量：9
- 2015年
- 蚕桑丝绸产业的主体产品是蚕丝,蚕丝性能改良的技术创新之于蚕桑丝绸产业的重要性和迫切性,尤其体现在蚕丝遗传改良相关的生物技术上。近年来,锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活效应子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列系统(CRISPR/Cas9)等基因组编辑技术的产生与发展,已经在生命科学基础理论研究、经济物种的遗传改造以及人类疾病的预防与治疗等领域掀起了一场如火如荼的革命。在家蚕基因组生物学国家重点实验室的研究团队和中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所、日本国立农业生物资源研究所等国内外同仁的努力下,家蚕的研究也紧跟时代潮流,建立了基因组编辑技术体系,并跻身于众多模式生物基因组编辑技术的前沿阵列。更为可喜的是,部分家蚕基因组编辑的论文发表以后,得到了生命科学界、蚕桑丝绸业界和政府相关部门对蚕业科技的极大关注,其中有多篇SCI论文被高频次引用,蚕桑丝绸业界长期关注和难以解决的蚕丝遗传改良、丝腺生物反应器等问题在基因组编辑技术的介入后有望得到快速突破。本文就家蚕基因组编辑技术带给传统蚕桑丝绸产业的机遇,以及该项技术的发展、应用现状和前景作简要总结,以供研究者借鉴和参考。
- 马三垣夏庆友
- 关键词：家蚕锌指核酸酶
- 基于同源重组的产绿色荧光蚕丝转基因家蚕的制备
- 2013年
- 采用基因打靶技术对家蚕丝素蛋白基因(fib)进行分子设计与遗传改造,探讨从基因水平改良蚕丝性能的可行性。以家蚕丝素轻链基因(fib-L)终止密码子TAA上游1.2 kb(fib-LL)和下游0.5 kb(fib-LR)片段作为基因打靶载体的左右同源臂,将绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到两同源臂的中间,并使其与fib-L基因处于同一读码框,构建基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。将该载体质粒转染BmN细胞后,荧光显微镜下观察细胞呈现绿色荧光,表明载体构建成功。将该载体质粒通过精子介导法导入家蚕品种高白的卵,在G0代筛选出茧呈绿色荧光的家蚕,并通过PCR检测证实其为转基因家蚕;用GFP抗体对G3代转基因家蚕幼虫后部丝腺组织进行Western blotting检测,有分子质量为65 kD的Fib-L-GFP融合蛋白特异性条带呈现。转基因家蚕所产蚕丝在蓝光的激发下发出绿色荧光,表明通过基因打靶将gfp导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。
- 李静芝曹广力杨李阳薛仁宇黄元姣贡成良
- 关键词：家蚕基因打靶绿色荧光蛋白基因
- 增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕的主要经济性状调查被引量：4
- 2012年
- 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是对养蚕业危害最严重的病原之一,采用传统育种方法培育家蚕抗性品种存在经济性状和抗性呈负相关的矛盾。为了确定转基因方法能否突破该瓶颈,对先前利用家蚕品种大造建立的增量表达内源性抗病毒基因Bmlipase-1的转基因家蚕系统LI-A的主要经济性状进行调查。结果显示,LI-A的4、5龄幼虫逐日体质量及产茧量性状成绩与正常大造之间没有明显的差异,表明转基因抗病毒家蚕系统LI-A在抗性提高的同时,经济性状没有受到影响。
- 蒋亮孙强金盛凯徐美茜程廷才夏庆友
- 关键词：家蚕核型多角体病毒转基因经济性状家蚕
- 家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析被引量：1
- 2013年
- 多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。
- 徐曼谈娟张奎王雪崔红娟
- 关键词：家蚕QRT-PCR
- 猫ω型干扰素在家蚕杆状病毒表达系统的表达及活性检测被引量：1
- 2015年
- 将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家蚕生物反应器表达猫ω型干扰素。采用微量细胞病变抑制法在CRFK细胞/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫血淋巴中表达的重组猫ω型干扰素具有抗病毒活性,其中表达产物重组Fe IFN-ω2的抗病毒活性可达6.3×105U/m L,而重组Fe IFN-ω9的抗病毒活性较低。研究结果为利用家蚕生物反应器生产重组猫ω型干扰素生物制剂奠定了一定的试验基础。
- 陈晓妍李皓洋胡小元吕言娜李轶女张志芳易咏竹
- 关键词：抗病毒活性
- 硫酸二乙酯对家蚕毒性的半致死剂量测定
- 2012年
- 硫酸二乙酯(DES)是一种能诱导生物体产生随机点突变的烷化剂。为了完善利用DES诱导家蚕突变的实验技术,采用不同剂量DES分别处理家蚕蛹、蛾、卵,检测DES对不同发育时期家蚕毒性的半致死剂量(LD50),结果表明DES对不同发育时期家蚕的LD50值存在显著差异:化蛹第5天的雌雄蛹分别为2 333.90μg/头和2 369.50μg/头;刚羽化雄蛾为156.39μg/头;蚕卵为13.23 mg/mL。研究结果可作为DES对家蚕的最适诱变剂量和家蚕诱变最佳发育时期选择的参考依据。
- 杨瑜林英杨从文罗娟沈关望张海燕夏庆友
- 关键词：家蚕突变硫酸二乙酯毒性半致死剂量
- 利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素被引量：2
- 2016年
- 牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素（BoIFN-α）及牛λ1干扰素（BoIFN-λ1）。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数（CAI）值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV＊GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。
- 吕言娜杨鑫李轶女胡小元张志芳易咏竹
- 关键词：杆状病毒表达系统家蚕抗病毒活性
- 家蚕GH18家族几丁质酶的系统进化和BmChi的时期表达分析被引量：4
- 2012年
- 昆虫GH18家族几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、细胞增殖和免疫等生理过程。为了系统开展家蚕GH18家族基因的研究,通过多物种几丁质酶的系统进化分析鉴定了8个家蚕GH18家族成员,并根据含有糖苷水解酶18(Glyco_18)催化结构域和几丁质结合结构域的不同将其分为6类,其中,各物种的CHT5具有典型几丁质酶结构。家蚕GH18家族成员中,BmChiR-1具有5个Glyco_18催化结构域和6个几丁质结合结构域,其它7个成员均只有1个Glyco_18催化结构域,BmCHT12还有1个ChitnaseA_N端结构域。8个家蚕GH18家族成员的基因分布在7条染色体上。通过半定量RT-PCR调查家蚕CHT5基因Bm-Chi在家蚕各发育时期的转录表达模式,该基因在蜕皮、化蛹、羽化等发育时期均有高水平表达,推测BmChi在蚕体旧表皮几丁质的降解过程中发挥重要作用。
- 高颂刘立会刘仕平王伟陆改夏庆友
- 关键词：家蚕蜕皮几丁质酶系统进化基因表达
- 家蚕卵黄原蛋白(BmVg)基因启动子的克隆与活性鉴定
- 2014年
- 卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)在家蚕蛹期脂肪体高量表达,研究家蚕卵黄原蛋白基因(BmVg)的转录调控机制及启动子活性,将有助于利用家蚕蛹生物反应器高效表达外源蛋白。设计特异引物,以家蚕蛹基因组DNA为模板PCR扩增得到BmVg长约1.5 kb的启动子片段。构建由不同长度截短BmVg启动子片段驱动荧光素酶报告基因表达的细胞转染载体pGL3-Vg Promoter,分析转染家蚕胚胎培养细胞BmE-SWU1中的BmVg启动子片段活性,结果显示最低截短至BmVg基因翻译起始位点上游90 bp的启动子片段具有转录活性。进一步用截短法分析不同长度启动子的活性,当启动子-752^-952 bp、-42^-152 bp区域被截掉后,启动子的转录活性明显降低,暗示这2个区域内可能存在与启动子启动效率相关的重要调控元件。
- 杨从文沈关望张海燕彭芷昕陈恩祥邢润苗刘红玲韩超珊林英
- 关键词：启动子克隆家蚕蛹
