浙江省自然科学基金(R2080407)
- 作品数：8 被引量：11H指数：3
- 相关作者：高基民许晓玲胡志明吴小兵董小岩更多>>
- 相关机构：温州医学院南方医科大学中国疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金国家高技术研究发展计划浙江省重大科技专项基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定被引量：1
- 2012年
- 以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。
- 唐佳许晓玲聂小霞茅奇峰高基民
- 关键词：重组人白细胞介素11原核表达纯化生物学活性
- 可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测被引量：4
- 2010年
- 本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确,sTNFRII-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明,sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此,本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。
- 陈素云何秋山董小岩吴小兵高基民
- 关键词：脂联素融合蛋白真核表达
- SA-IL-7融合蛋白的制备及其膀胱内灌注对小鼠表浅性膀胱癌的治疗效应被引量：2
- 2013年
- 目的:制备链亲和素标记的白介素7(streptavidin-tagged interleukin-7,SA-IL-7)融合蛋白,评价其对小鼠表浅性膀胱癌治疗的效果。方法:构建pET24a-SA-IL-7重组质粒,制备SA-IL-7融合蛋白。流式细胞术检测SA-IL-7融合蛋白与生物素化膀胱癌细胞MB49的结合,胸腺细胞增殖法检测SA-IL-7融合蛋白促进胸腺细胞增殖的生物学活性。应用小鼠表浅性膀胱癌模型评价膀胱内灌注SA-IL-7的治疗效果,观察小鼠生存期,免疫组化法检测各组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞。结果:成功制备的SA-IL-7融合蛋白可锚定于生物素化的MB49细胞表面,结合率达(96.6±1.3)%;同时能够促进胸腺细胞的增殖。SA-IL-7融合蛋白能够锚定于小鼠生物素化的膀胱黏膜表面7 d以上,而未生物素化的膀胱黏膜在始终未检测到IL-7的存在。在小鼠表浅型膀胱癌模型中,MB49细胞接种后的第80天,IL-7灌注治疗组90%小鼠死亡,而SA-IL-7组60%小鼠存活且未出现肿瘤(P<0.05);且SA-IL-7灌注治疗组小鼠肿瘤组织中浸润CD8+T细胞明显增多(P<0.01)。SA-IL-7治愈的15只表浅型膀胱癌模型小鼠中,11只能够抵抗膀胱内MB49细胞的第二次接种,而对照组15只小鼠仅1只幸存(P<0.01)。结论:SA-IL-7融合蛋白膀胱内灌注能够产生抗肿瘤免疫应答和明显的治疗效果,有可能成为免疫治疗浅表性膀胱癌的新方法。
- 张振贺利民马磊李金龙许晓玲高基民
- 关键词：白细胞介素7链亲和素融合蛋白表浅性膀胱癌
- 链亲和素标记的白细胞介素4双功能融合蛋白锚定治疗小鼠浅表性膀胱癌被引量：3
- 2012年
- 目的探讨链亲和素标记的白细胞介素4（IL-4-SA）双功能融合蛋白治疗小鼠浅表性膀胱癌的效果。方法制备IL-4-SA双功能融合蛋白，测定其体外生物学活性。建立小鼠浅表性膀胱癌模型，膀胱经生物素化后给予IL4-SA灌注治疗，观察小鼠生存期，并以链亲和素标记的绿色荧光蛋白（GFP—SA）＋IL-4和磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照组。检测各组小鼠脾细胞的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性和CD8＋肿瘤浸润淋巴细胞。结果IL4．SA能够锚定于生物素化的膀胱表面达5d以上。在MIM9细胞种植后的第80天，PBS组小鼠全部死亡，GFP-SA＋IL-4组小鼠存活2只，而IL4-SA组小鼠存活5只。在肿瘤特异性杀伤实验中，在效靶比为1：1、25：1、50：1时，PBS组小鼠的CTL杀伤率分别为（3．3±0．6）％、（7．3±0．6）％和（12．7±2．1）％，GFP．SA＋IL4组小鼠的CTL杀伤率分别为（4．3±0．6）％、（9．0±1．0）％和（14．3±1．5）％，而IL4-sA组小鼠的CTL杀伤率分别为（11．3±1．2）％、（22．7±1．5）％和（31．0±3．0）％，IL4-SA组与PBS组和GFP—SA＋IL-4组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。CD8＋淋巴细胞检测结果显示，PBS组和GFP．SA＋IL4组的肿瘤组织内仅有少量的CD8＋淋巴细胞浸润，而IL-4-SA组则有较多的CD8＋淋巴细胞浸润。结论IL4-SA锚定膀胱表面能够产生强烈、持久的免疫应答反应，有可能成为浅表性膀胱癌的一种新灌注治疗方法。
- 张振许晓玲马磊李金龙胡志明高基民
- 关键词：膀胱肿瘤白细胞介素4链亲和素融合蛋白小鼠
- hIL-15-SA双功能融合蛋白的制备被引量：1
- 2010年
- 目的:对双功能融合蛋白hIL-15-SA的发酵及纯化工艺进行研究。方法:采用发酵罐高密度发酵hIL-15-SA工程菌,通过镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化目的蛋白。免疫印迹分析产物,淋巴细胞增殖试验以及细胞锚定试验检测双功能融合蛋白hIL-15-SA的生物学活性。结果:采用半合成培养基,以3%的接种量,pH值为7.2发酵可得到湿菌47 g/L,21.15 g/L包涵体。经纯化后目的蛋白纯度为97%。细胞增殖试验和细胞表面锚定修饰试验表明,经纯化复性的hIL-15-SA融合蛋白具有双重生物活性。结论:本研究获得了高产量、高纯度的hIL-15-SA双功能融合蛋白,为后续的体内生物学功能研究奠定了基础。
- 余宏盛严耀明茅奇峰高基民
- 关键词：白细胞介素15链亲和素融合蛋白中试工艺
- SA-hIL2双功能融合蛋白的研制及其生物学鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法:构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性。CCK-8法检测SA-hIL2融合蛋白对PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性,流式细胞仪分析SA-hIL2融合蛋白对生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-hIL2在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体总蛋白的20%,制备的SA-hIL2融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即hIL-2促进PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性和SA介导的高效结合至已生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面的功能(表面锚定修饰效率约95%)。结论:研制的SA-hIL2融合蛋白具有双重活性,可为研制表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。
- 张琳胡志明法萍萍梁中锟高基民
- 关键词：白细胞介素2链亲和素融合蛋白
- SA/mIL15双功能融合蛋白的制备及其生物学鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和阴离子交换(DEAE)层析进行纯化,透析复性。MTT法检测融合蛋白对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)分析融合蛋白对生物素化的小鼠前列腺癌(RM-1)细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-mIL15和mIL15-SA在大肠杆菌中实现了高效表达,约占细菌总蛋白的20%。制备的SA-mIL15和mIL15-SA融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即:mIL15促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞的增殖活性和SA介导的高效结合至表面已生物素化的RM-1细胞的功能(表面锚定修饰效率均大于95%)。其中,SA-mIL15双功能融合蛋白促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞增殖活性为1×106IU/mg,mIL15-SA活性为2×105IU/mg。结论:SA/mIL15双功能融合蛋白具有双重活性,为mIL15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制奠定了基础。
- 陈艳丽许晓玲唐佳聂小霞宋志纯胡志明高基民
- 关键词：白细胞介素15链亲和素融合蛋白
- 腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备被引量：3
- 2011年
- 利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量（MOI）（0-1 000）感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI（0~1 000）感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学�
- 陆月刘丹张孝任刘雪荣沈炜郑刚柳云帆董小岩吴小兵高基民
- 关键词：腺病毒重组蛋白哺乳动物细胞
