【目的】深入了解花生胚发育的分子机制,获得花生胚发育相关基因。【方法】以优质花生品种闽花6号为材料,分别取花生果针入土后10、20、30、40、50和60 d(day after pegging,DAP)的胚作为试验材料,用CTAB法提取花生胚总RNA,采用SMART(Switching Mechanism At 5’end of RNA Transcript)技术合成双链cDNA,经SfiⅠ酶切后胶回收纯化双链cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库,进行小规模测序。采用生物信息学分析手段对所获得的EST进行功能注释。【结果】构建了不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库,文库的库容为3.5×106cfu/mL,重组率95.8%,插入片段长度在500—2 000 bp,平均长度超过1 000 bp。随机挑取60个克隆进行5′端测序,共得到60条高质量的EST序列,BLASTX结果显示,有39条序列(65%)与GenBank中大豆、花生、苜蓿等植物上已公布的序列有较高同源性,其中,有32条具有已知或推测的功能,7条序列功能未知。其余21条(35%)序列在NCBI的非冗余蛋白数据库中没有找到与之相匹配的序列,可能为花生新的EST序列。利用BLAST2GO对所得序列进行GO注释分析,结果表明,参与抗逆与防御、蛋白质合成与运输、油脂合成与代谢、转录与调控以及种子萌发、休眠、胚发育相关的基因比较丰富,还有部分基因参与信号传导以及光形态建成等过程。KEGG代谢途径分析表明,随机测序所获得的序列中主要包括α-亚麻酸代谢和亚油酸代谢。【结论】利用SMART技术成功构建了不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库;小规模EST测序分析获得了部分与花生胚发育相关的基因,如亚油酸9S-脂肪氧合酶、油体蛋白、锌指蛋白、热休克蛋白90、胚胎发育晚期丰富蛋白、脂肪氧合酶以及DREB转录因子等。
