国家科技重大专项(2012ZX10003008)
- 作品数：6 被引量：17H指数：2
- 相关作者：王洪海粟海波朱琳孔聪黄琪更多>>
- 相关机构：复旦大学四川大学第四军医大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项上海市科学技术委员会基础研究重点项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 全球结核病疫苗研究进展被引量：10
- 2017年
- 本文旨在对全球结核病疫苗研究进展进行系统综述,描述国际上目前进入临床试验不同阶段的新型疫苗,包括重组卡介苗、亚单位疫苗、治疗性疫苗等,分析我国结核病疫苗研究现状,介绍国际研究发展趋势,如人类疫苗计划、全细胞疫苗、多阶段疫苗等,并对存在的问题和挑战进行讨论,展望未来发展趋势。
- 王洪海
- 关键词：结核病结核病疫苗重组卡介苗亚单位疫苗
- 结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究被引量：4
- 2016年
- 目的用结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）特异性抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂（incom-pleteFreund’s adjuvant，IFA）构建结核亚单位疫苗（Rv3400-IFA），在C57BL／6小鼠体内评估其免疫效应。体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264．7并评估其免疫应答。方法PCR扩增基因Rv3400，构建重组质粒pET28a（＋）-Rv3400，转人大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，诱导表达并纯化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖（1ipop01ysaccharides，LPS），分别刺激小鼠巨噬细胞RAw264．7，阴性对照为未刺激的巨噬细胞，流式细胞术检测细胞表面分子表达，收集细胞培养上清，ELISA检测细胞因子的分泌。另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠；C57BL／6小鼠采用数字表法随机分为3组，分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、阴性对照组IFA组，每组5只，每2周1次、共免疫3次。分别采用酶联免疫斑点检测技术（enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估。结果（1）成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400。（2）体外细胞实验结果显示：Rv3400抗原刺激巨噬细胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCII表达量显著提高，阳性细胞比率[分别由未刺激的（34．70±2．40）％、（31．25±18．31）％、（41．80±6．01）％、（44．30±0．44）％提高至1μg/mlRv3400抗原刺激后的（90．45±7．71）％、（90．10±4．10）％、（89．97±7．79）％、（85．13±5．12）％]；能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-a，TNF-a）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），分别达（49217．0±390．61）pg／ml、（1783．4±51．18）pg／ml。（3）免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌INF-7的斑点形成细胞（spotfo
- 朱琳徐颖孔聪粟海波黄琪朱胜玲王洪海
- 关键词：分枝杆菌结核亚单位疫苗细胞免疫体液免疫
- 结核杆菌CRISPR-associated Csm4(Rv2820c)诱导iNOS表达对耻垢杆菌胞内存活的影响被引量：2
- 2018年
- 目的研究Csm4蛋白在重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)中的表达及其影响胞内存活的机制。方法 PCR扩增Csm4基因,构建重组pMV261-Csm4穿梭表达质粒,将重组质粒和空白质粒电穿孔进MS生成重组菌MS_Csm4和对照重组菌MS_V,采用Western blot对重组菌Csm4蛋白表达进行检测。体外培养观察MS_Csm4和MS_V生长曲线,并检测活性氮、活性氧环境下的集落形成单位(CFU)变化。MS_Csm4和MS_V重组菌感染人源巨噬细胞THP-1,计数CFU反映胞内存活,实时荧光定量PCR检测诱导性一氧化氮合酶基因(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达。硝酸还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)释放指标。结果 Csm4蛋白在MS_Csm4中成功表达,且其表达不影响MS_Csm4的生长情况;MS_Csm4在体外活性氮、氧环境中CFU下降,与MS_V相比,差异有统计学意义(P<0.05);重组菌MS_Csm4作用于THP-1细胞后诱导iNOS表达上调,促进NO的释放以及减少胞内生存,与MS_V相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组菌MS_Csm4不能耐受体外活性氮、氧压力环境,可诱导宿主细胞iNOS表达上调,促进NO释放,从而影响其胞内生存能力。
- 翟小倩鲍朗罗涛彭璇孙长峰杨国平
- 关键词：重组耻垢分枝杆菌
- 结核分枝杆菌Rv3425与Rv3614c的相互作用被引量：1
- 2015年
- 为探究结核分枝杆菌脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(PPE)蛋白家族Rv3425的生物学功能,利用免疫共沉淀联合质谱分析,在卡介苗(BCG)中筛选与Rv3425相互作用的蛋白。首先,以聚合酶链反应(PCR)扩增获得Rv3425基因,并克隆于pMV261载体。将重组载体转化入BCG,裂解细胞,蛋白免疫印迹法证实目的蛋白可在BCG中表达。通过免疫共沉淀,用特异抗体分离出BCG中的Rv3425蛋白复合体,质谱鉴定其成分,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中检索各蛋白的功能,筛选与Rv3425相互作用的蛋白,并用谷胱甘肽S-转移酶(GST)pulldown验证。结果显示,免疫共沉淀联合质谱分析筛选到10个与Rv3425相互作用的蛋白,在细胞内Rv3425协同作用下参与肽聚糖合成途径、分枝菌酸合成途径、ESX-1蛋白分泌系统及细菌毒力调控。GST pulldown验证发现Rv3614c与Rv3425可体外结合。本研究证实Rv3425与Rv3614c存在相互作用,Rv3425可能与ESX-1蛋白分泌系统及结核分枝杆菌致病机制密切相关。
- 黄琪徐文玺粟海波李光华宋娜孔聪朱琳王洪海徐颖
- 关键词：结核分枝杆菌免疫共沉淀蛋白质相互作用
- 结核分枝杆菌持续感染小鼠模型的建立及其免疫特征
- 2014年
- 为建立小鼠结核分枝杆菌持续感染模型并研究其免疫应答特征,选取雌性C57BL/6小鼠,经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv株,并以异烟肼和利福平联合治疗。分别于感染后4、8、12周处死小鼠,用平板法计数肺和脾荷菌数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中特异性抗体水平及亚类,流式细胞术检测CD4+脾淋巴细胞经结核分枝杆菌抗原——纯化蛋白衍生物(PPD)刺激后分泌细胞因子的细胞比例。结果显示,感染4周后小鼠肺和脾荷菌数lg CFU分别达3.67±0.25和3.54±0.24,至少持续8周;药物治疗可有效降低脏器荷菌数。感染12周后,感染组血清中抗结核分枝杆菌特异性抗体水平显著升高(P<0.01),且以IgG1为主;治疗组总IgG抗体水平显著低于感染组(P<0.01),且IgG2a相对较高(P<0.05)。感染组CD4+脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)分泌细胞比例显著增加(P<0.01和P<0.001),而IL-4分泌细胞比例显著降低(P<0.01);治疗组IL-2和IL-4分泌细胞比例显著低于正常组(P<0.05和P<0.01)。本研究建立的小鼠结核分枝杆菌持续感染模型有望用于结核病治疗性疫苗和药物的研发及筛选。
- 许承明康健王丽梅韩文东孙志平丁悦娜瞿涤柏银兰徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌小鼠模型
- 表达结核分枝杆菌融合抗原TB10.4-HspX的重组酵母免疫效果研究
- 2015年
- 结核病是一种严重危害人类健康的传染病,其防治难点主要在于抗药性菌株的出现以及唯一的抗结核疫苗——卡介苗的效果不理想.为发展新型抗结核疫苗,本研究中构建了表达结核分枝杆菌融合抗原TB10.4-HspX(TB10H)的重组酿酒酵母,分别以皮下注射和滴鼻两种方式免疫小鼠,检测免疫效果.结果显示,该重组酿酒酵母通过皮下注射的方式免疫后刺激小鼠产生TB10H特异性抗体IgG,分泌Th1型细胞因子IFN-γ,而且重组酵母免疫后在一定程度上刺激小鼠树突状细胞的成熟分化和抗原递呈作用.一系列结果表明,表达融合抗原TB10H的重组酿酒酵母能够有效激发小鼠抗原特异性免疫应答.
- 张宇飞陆健刘建平王洪海
- 关键词：结核病疫苗重组酿酒酵母HSPX
