云南省应用基础研究计划面上项目(2010ZC241)
- 作品数：5 被引量：7H指数：2
- 相关作者：霍金龙刘丽仙赵跃霍海龙曾养志更多>>
- 相关机构：云南农业大学云南农业职业技术学院昆明医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究计划面上项目云南省教育厅科学研究基金国家自然科学基金更多>>
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- 版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测
- 2012年
- 为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。
- 赵跃王锐霍金龙刘丽仙霍海龙杨成海曾养志
- 版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立
- 2011年
- 目的快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品。方法利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。结果建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达103和105拷贝,线性范围分别为103～109和105～109拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R2分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%。结论成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。
- 霍金龙李颖赵跃潘伟荣刘丽仙霍海龙曾养志
- 关键词：实时荧光定量TNF-Α基因基因表达
- 猪胰岛素样生长因子-Ⅰ的克隆及生物信息学分析被引量：4
- 2014年
- 为了克隆猪胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-I)以及检测该因子在各组织中的转录水平,分别提取猪13种组织RNA并反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增IGF-I编码区全长序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与牛等5个物种构建系统进化树。同时采用半定量RT-PCR方法分析IGF-I在猪13种组织中的表达情况。结果显示,猪IGF-I编码区全长462 bp(GenBank登录号:JX827417),编码153个氨基酸。氨基酸二级结构预测表明无规卷曲占的比例最大,为57.52%。氨基酸序列同源性分析表明,与牛、马、羊、鹿、鸡等5个物种的相似性分别为98.0%、97.4%、96.1%、96.1%、83%,多组织半定量RT-PCR研究表明IGF-I mRNA在猪的13个组织中均有表达,其中在肌肉、肝脏、脾脏、卵巢、大肠中表达量较高,其他组织略低。
- 王锐赵跃张永云李卫真王淑燕霍海龙刘丽仙苗永旺霍金龙
- 关键词：胰岛素样生长因子基因克隆生物信息学分析
- 版纳微型猪近交系TNF-α基因克隆、序列分析及分子系统进化研究被引量：1
- 2012年
- 分别提取版纳微型猪近交系18种组织的RNA,反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增肿瘤坏死因子(TNF-α)基因编码区全长序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与其他15个物种构建系统进化树。同时采用半定量RT-PCR方法分析TNF-α基因在版纳微型猪近交系18种组织中的表达情况。结果显示,版纳微型猪近交系TNF-α基因编码区全长699 bp(GenBank登录号:JF831365),编码232个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与猫等12个物种具有80%以上的相似性,分子系统进化表明与牛、山羊、绵羊及海豚的关系较近。多组织半定量RT-PCR研究表明,TNF-αmRNA在版纳微型猪近交系的多个组织中均有表达,其中在中脑、卵巢、脾、肺、神经及胃中表达量较高。
- 赵跃王锐霍金龙刘丽仙霍海龙朱国琪曾养志
- 关键词：TNF-Α基因系统进化
- 血管内皮生长因子(VEGF)实时荧光定量PCR质粒标准品的构建被引量：2
- 2011年
- 应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103～1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92%)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品,为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。
- 刘丽仙霍金龙李颖赵跃霍海龙曾养志
- 关键词：实时荧光定量VEGF基因
