国家自然科学基金(81070738)
- 作品数：3 被引量：8H指数：1
- 相关作者：吴强胡健艳李婷婷贾丽丽陈永东更多>>
- 相关机构：上海交通大学附属第六人民医院苏州大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测被引量：1
- 2014年
- 目的构建靶向大鼠G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91,GPR91)基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,探讨GPR91受体对高糖诱导下血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)释放的调节作用。方法设计合成4对针对大鼠GPR91(NM_001001518)的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入Age I和EcoR I酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链DNA,克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定重组体。将各慢病毒shRNA干扰载体和辅助包装载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测。将各慢病毒载体转染RGC-5细胞后,Western blot法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体。使用45 mmol·L-1的高糖刺激RGC-5细胞24 h,用ELISA法观察干扰GPR91后VEGF的表达情况。结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGCSIL-GFP-shGPR91构建正确;包装病毒颗粒后,pGCSIL-GFP-shGPR91-1、2、3、4组病毒浓缩液的滴度依次为1.5×109 TU·mL-1、1.5×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1。将慢病毒颗粒感染RGC-5细胞后,Western blot检测显示NC组GPR91蛋白(0.60±0.08)空白组(0.62±0.07)的表达无明显差异(F=49.03,P>0.05)。而与空白组相比,4个慢病毒载体组(0.48±0.05、0.34±0.06、0.30±0.04和0.11±0.06)均能不同程度沉默GPR91的表达,差异有统计学意义(F=49.03,P<0.01),其中pGCSIL-GFP-shGPR91-3干扰效率最高。ELISA结果显示空白组、高糖组、高糖+NC组、高糖+pGCSIL-GFP-shGPR91-3组VEGF蛋白表达分别为(25.63±4.52)pg·mL-1、(72.74±8.24)pg·mL-1、(71.68±8.31)pg·mL-1和(46.77±6.21)pg·mL-1,表明GPR91病毒干扰载体可显著降低高糖引起的VEGF分泌,差异有统计学意义(F=30.852,P<0.01)。结论本实验成功构建了靶向大鼠GPR91的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装。所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的VEGF表达,为进一步研究GPR91基因在糖尿病�
- 李婷婷胡健艳吴强
- 关键词：小发夹RNA慢病毒属糖尿病性视网膜病变血管内皮生长因子
- 大鼠视网膜微血管内皮细胞的原代培养及鉴定改进被引量：6
- 2012年
- 目的探讨大鼠视网膜微血管内皮细胞原代培养改进方法,为研究视网膜新生血管疾病的病理机制奠定基础。设计实验研究。研究对象大鼠视网膜微血管内皮细胞。方法采用机械剪除大鼠视网膜血管联合酶消化分离,用含胎牛血清、内皮细胞培养特制添加剂等的条件培养基培养及纯化大鼠视网膜微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。应用因子VIII、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）免疫鉴定细胞。主要指标微血管内皮细胞形态,免疫荧光染色。结果原代培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞贴壁后散在分布,呈单层排列,多为梭形,边界清楚,少量呈铺路石样螺旋向外生长,3-5天后融合,呈簇状单层分布。免疫荧光细胞染色显示,因子VIII抗体染色核周出现黄绿色荧光反应,CD31因子抗体染色以胞浆着色为主。细胞纯度较高,荧光染色阳性细胞率为95%。结论采用机械剪除大鼠视网膜血管、胰蛋白酶和胶原酶消化、含特制添加剂培养基的应用、明胶包被培养瓶等综合法可获得较纯的大鼠视网膜微血管内皮细胞。
- 胡健艳吴强宋蓓雯贾丽丽陈永东严良
- 关键词：视网膜微血管内皮细胞细胞培养
- G蛋白偶联受体91对早期糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响及机制被引量：1
- 2015年
- 目的观察G蛋白偶联受体9l（GPR91）对早期糖尿病大鼠血视网膜屏障（BRB）的影响及可能的作用机制。方法构建GPR9l小发夹RNA（shRNA）慢病毒载体pGCSIL-GFP-shGPR91及相应的慢病毒空载体pGCSIL-GFP-shSerambled。健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，随机分为对照组（A组）、糖尿病链脲佐菌素（STZ）组（B组）、空病毒LV．shScrambled组（C组）、病毒LV．shGPR91组（D组），每组均为15只大鼠。大鼠STZ腹腔注射2周后，C组大鼠玻璃体腔注射浓度为1×10^8TU／m1的空载体病毒1肛1；D组大鼠玻璃体腔注射浓度为1×10^8 Tu／m1的pGCSIL-GFP-shGPR91慢病毒1μl。注射后12周，免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠视网膜中GPR91及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的表达和激活情况。苏木精一伊红染色和伊凡思蓝（EB）渗漏试验观察大鼠视网膜微血管结构改变和渗漏情况。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）表达情况。结果免疫组织化学染色可见GPR91主要表达于大鼠视网膜神经节细胞层；Western blot检测结果显示，D组GPR91表达较C组显著降低，差异有统计学意义（F=39．31，P〈0．01）。光学显微镜观察发现，B、C组大鼠视网膜内层毛细血管较A组大鼠视网膜内层毛细血管明显扩张，D组大鼠视网膜内层扩张的毛细血管显著改善。EB渗漏试验结果显示，D组大鼠视网膜EB渗漏量较C组下降（33．8±4．11）％，差异有统计学意义（F=30．35，PG0．05）。ELISA检测结果显示，B、C组大鼠视网膜VEGF蛋白表达较A组明显增加；D组大鼠视网膜VEGF蛋白表达较C组显著下降，差异有统计学意义（F=253．15，P〈0．05）。Western blot检测结果显示，B组大鼠视网膜细胞外信号调节激酶（ERK）1／2、c-jun氨基末端激酶、p38MAPK通路均激活，B组各比值与A组比较，差异有统计学意义（q=6�
- 胡健艳李婷婷吴强
- 关键词：小分子干扰受体血管内皮P38丝裂原活化蛋白激酶类
