国家自然科学基金(30471242)
- 作品数：9 被引量：79H指数：4
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- 莎能奶山羊皮肤成纤维细胞几种冷冻保存方法的研究被引量：4
- 2005年
- 以莎能奶山羊皮肤组织为材料进行细胞培养,通过分离纯化建立了莎能奶山羊皮肤成纤维细胞系。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的条件下选用5种具有不同预冷平衡方式和预冷时间的方法进行冷冻保存,5个月后通过对成纤维细胞复苏后的活力对比分析,方法3(70%细胞悬液+20％胎牛血清+10％DMSO;先在4 C预冷平衡0．5 h,接着液氮罐口气态氮悬挂4 h,然后沉入液氮)冻存细胞解冻后胎盘蓝染色细胞活力分析,活细胞率为84．8％,培养48 h后细胞贴壁率为85．4％,明显高于其他几种方法。
- 王亮刘婷婷彭涛帅志强张达江朱海陈军李卫华汪汉卿
- 关键词：莎能奶山羊成纤维细胞细胞培养冷冻保存
- 人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法被引量：3
- 2009年
- 构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒（PGC1-collagen）,利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以未转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGC1-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证。结果显示：在6孔培养板中细胞融合度达到50%~60%左右介导1~3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%~30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达。在使用800 U的G418筛选效果最好,维持浓度300~600 U,获得25个稳定表达的阳性细胞系,从中选取6个克隆进行PCR验证。成功利用脂质体转染方法将人Ⅰ型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确。
- 刘婷婷王亮吕自力彭涛王安江
- 关键词：胶原基因转染成纤维细胞阳性克隆
- Ⅰ型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景被引量：53
- 2006年
- 胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白,在哺乳动物中的含量是整个生物体自身总蛋白含量的1/4。胶原蛋白除了具有生物力学方面的作用以外,还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能;此外,在食品、化妆品、医药等行业中,胶原蛋白也具有很广泛的用途。随着对胶原蛋白需求的日益增加,原先从屠宰的动物体的皮革、骨骼中提取胶原的方式已经不能满足日益增长的胶原蛋白的需求,而且还可能有致病之虞,于是新的生产胶原蛋白的方法——利用生物反应器,尤其是乳腺生物反应器来生产胶原蛋白就为人们所瞩目。本文就Ⅰ型胶原蛋白的结构、功能,以及利用生物反应器研究开发Ⅰ型胶原蛋白的现状、前景进行了探讨。
- 张达江王亮
- 关键词：胶原蛋白生物反应器转基因
- 携带人Ⅰ型а1原胶原基因荷斯坦奶牛胚胎的发育研究
- 2009年
- 克隆了人Ⅰ型а1原胶原的cDNA基因,将克隆的基因连接到改造后的乳腺特异性表达载体pGC1上,经电穿孔法转染到成纤维细胞中,利用核移植技术获得携带人Ⅰ型а1原胶原基因牛胚胎。最终获得8枚转基因的囊胚,证明用核移植方法获得的携带人Ⅰ型а1原胶原蛋白基因的荷斯坦奶牛胚胎能够正常发育。
- 彭涛刘婷婷王亮
- 关键词：核移植转基因
- 不同电融合条件对莎能奶山羊转基因(GFP)核移植胚胎发育的影响被引量：4
- 2006年
- 以莎能奶山羊(Saanen dairy goat)转基因(GFP)成纤维细胞为核供体细胞,以普通山羊卵母细胞为受体细胞进行了核移植,试验中对转基因核移植胚胎的电融合条件进行了优化,发现对于莎能奶山羊转基因(GFP)重构胚胎的处理,电融合时方案B(1.5kV/cm、30μs/次、间隔1s)电融合参数最适合用于莎能奶羊的转基因(GFP)核移植胚胎,其重构卵电融合率为89.4%,重构胚分裂率为68.0%。
- 王亮彭涛刘婷婷汪汉卿曹旭朱海吕自力张达江蔡涛高红
- 关键词：转基因核移植电融合体细胞克隆
- 荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究被引量：11
- 2006年
- 试验对荷斯坦奶牛耳组织成纤雏细胞的分离、体外培养及5种冷冻保存方法进行了研究。结果表明：用DMEM／F12＋20％胎牛血清＋100IU／mL双抗的完全培养液进行组织块培养，能获得良好的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞原代培养物；成纤维细胞混合培养物经Trypsin-EDTA（0．25％Trypsin，1mmol／LEDTA．4Na）消化所收集到的细胞主要为成纤维细胞，经2—3代传代，可得到纯化的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的每件下，选用5种不同的冷冻保存方法进行冷冻保存，其中使用70％细胞悬液＋20％胎牛血清＋10％DMSO的冷冻保存悬液，先在4℃预冷平衡0.5h，接着在液氮罐口的气态氮中悬挂4h，然后沉入液氮的方法冻存的细胞，解冻后，经台盼蓝染色后进行细胞活力分析，活细胞率为86．68％；培养48h后细胞贴壁率为86．40％，明显高于其他几种方法。
- 王亮刘婷婷彭涛朱海汪汉卿曹旭
- 关键词：荷斯坦奶牛成纤维细胞体外培养冷冻保存
- 转GFP基因核移植牛胚胎的研究被引量：1
- 2009年
- 试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白(GFP)-新霉抗性(neo-)双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF(表皮生长因子)对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著(P>0.05);mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。
- 邓守龙吕自力王亮王安江曹文广
- 关键词：转基因体外培养
- GC含量丰富的人I型原胶原蛋白基因片段克隆及其序列分析被引量：1
- 2007年
- 鉴于做转基因牛羊乳腺生物反应器的需要,根据GenBank中所公布的人I型原胶原蛋白基因序列设计引物,利用健康人的胎盘中提取的基因组DNA为模板,通过优化的长距离PCR,成功地克隆出GC含量丰富的人I型原胶原基因组DNA片段,序列测定与分析的结果显示中国人I型原胶原蛋白基因组DNA片段与GenBank中所公布出来的序列所对应的部分有99.5%的同源性,其中外显子部分与GenBank中的对应部分完全一致;而在内含子中,本研究克隆到的基因与GenBank中公布出来的序列有不少差异,尤其表现在内含子1和2中,其中内含子2要比GenBank中公布的基因内含子2多出14个碱基,这14个碱基具体有什么作用尚需要进一步阐明,内含子间的差异凸显了东西方人种之间基因序列的多态性。
- 张达江王亮
- 关键词：COL1A1基因克隆
- 电融合条件对新疆盘羊(Ovis ammon)和转基因(GFP)萨能奶山羊核移植胚胎发育的影响被引量：4
- 2006年
- 以新疆野生盘羊(Ovis ammon)和萨能奶山羊转基因(GFP)成纤维细胞为核供体细胞,分别以绵羊卵母细胞和普通山羊卵母细胞为受体细胞进行了核移植,对不同种类核移植重构卵进行电融合处理,发现盘羊重构卵电融合参数为1.4 kV/cm、20μs/次、间隔1 s时的重构卵融合率最高;对于转基因(GFP)萨能奶山羊重构卵的处理,电融合前先放入融合液中于38.5℃下平衡5 min,融合时电融合参数为1.5 kV/cm、20μs/次、间隔1 s时的融合率最高。实验中发现将融合后的两种重构胚胎先置入IVM培养液中于38.5℃下平衡4 h,可降低重构胚胎的死亡率,提高发育质量和卵裂率。
- 王亮彭涛朱海吕自力帅志强刘婷婷高红蔡涛曹旭汪汉卿
- 关键词：转基因核移植电融合
