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表没食子儿茶素没食子酸酯的甲基化分子修饰被引量：19: 2010年; 研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的甲基化分子修饰。以碘甲烷作为甲基供体,采用化学合成方法研究EGCG的甲基化分子修饰,并通过HPLC-MS和NMR等对反应产物进行结构鉴定。结果表明:采用化学合成方法能有效完成EGCG的甲基化分子修饰,并分离鉴定出5个EGCG甲基化衍生物,分别为4″-Me-EGCG、4′,4″-di-Me-EGCG、5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG、5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG、5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa-Me-EGCG。; 吕海鹏孙业良林智谭俊峰郭丽; 关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯甲基化分子修饰碘甲烷化学合成

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析被引量：11: 2013年; 【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。; 马成英吕海鹏林智张悦郭丽谭俊峰; 关键词：茶树原核表达

EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件研究被引量：4: 2012年; 以EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG生成EGCG3′′Me、EGCG4′′Me和EGCG3′Me等3种主要的EGCG甲基化衍生物的生成量为主要指标,考察了EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件。结果表明,EGCG甲基化衍生物的酶促合成最佳反应条件为:温度35℃,pH7.5,DTT和Mg2+的浓度为2 mmol/L;在该反应条件下,反应体系中EGCG3′′Me、EGCG4′′Me以及EGCG3′Me的生成量分别可达到386.39μg/mL、23.40μg/mL和107.01μg/mL。; 吕海鹏费冬梅张悦林智彭群华郭丽谭俊峰; 关键词：酶促合成

EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的EGCG甲基化衍生物分析被引量：6: 2012年; 研究了EGCG3′′Me、EGCG4′′Me和EGCG3′Me在正离子模式下的质谱裂解规律,并在此基础上分析了EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的反应产物。结果表明,EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG后反应体系中生成了10余种不同的EGCG甲基化衍生物,主要包括EGCG3′′Me、EGCG4′′Me、EGCG3′Me、EGCG5′Me、EGCG3′′,4′′-diMe、EGCG3′′,5′′-diMe、EGCG3′,5′-diMe、EGCG3′,5′′-diMe、EGCG3′,3′′,5′′-triMe,以及EGCG5′,3′′,5′′-triMe等。; 吕海鹏费冬梅张悦林智谭俊峰郭丽; 关键词：质谱裂解

茶树中咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的基因克隆及其催化活性研究(英文)被引量：4: 2015年; 目的:从茶树中克隆一种可以催化表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)生成甲基化EGCG的酶——咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCo AOMT),实现甲基化EGCG的酶学合成,为甲基化EGCG的进一步开发利用提供理论依据和技术指导。创新点:本研究首次从茶树中克隆了一条CCo AOMT基因组序列;分析了CCo AOMT基因在不同茶树品种和不同成熟度茶鲜叶中的基因表达规律;证明了CCo AOMT具有催化合成甲基化EGCG的生物活性。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)和序列分析获得CCo AOMT的编码序列和基因组序列;采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱技术(HPLC-QTOF-MS)分析酶促反应生成的甲基化EGCG产物(图4);采用实时荧光定量PCR分析CCo AOMT基因的表达差异(图5)。结论:本研究从茶树中克隆了CCo AOMT基因的编码序列(738 bp)和基因组序列(2678 bp),明确了该基因具有4个内含子和5个外显子;揭示了CCo AOMT可以催化EGCG生成EGCG4"Me、EGCG3"Me和EGCG3'Me等多种甲基化产物;证明了CCo AOMT具有催化生成甲基化EGCG的活性;并发现该基因的表达量高低与茶鲜叶的成熟度呈正相关关系。; Yue ZHANGHai-peng LVCheng-ying MALi GUOJun-feng TANQun-hua PENGZhi LIN; 关键词：茶树

茶树EGCG-O-甲基转移酶的纯化及酶学性质被引量：1: 2013年; 对重组茶树EGCG-O-甲基转移酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:经HisTMTrap层析纯化后,获得了纯度超过95%的重组融合蛋白,纯化倍数为22.51倍,酶活回收率为34.54%,酶比活力达到0.0186U/mg;酶分子质量约为27.6kD;该酶的最适反应温度为35℃、最适pH7.5;以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为底物,酶学动力学常数Km为0.100mmol/L,Vmax为7.485mg/(L min)。; 吕海鹏张悦费冬梅林智; 关键词：茶树纯化

EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)在重组大肠杆菌中的表达条件研究被引量：8: 2011年; 本研究以EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG生成EGCG3"Me的产量为主要指标,探讨了重组大肠杆菌内EGCG-O-甲基转移酶的诱导表达条件。结果表明,当诱导剂IPTG终浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为20 h,培养基初始pH为7.0,以及诱导温度为20℃时,EOMT的表达效果最佳。; 费冬梅林智吕海鹏张悦谭俊峰郭丽; 关键词：重组大肠杆菌

茶树氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达被引量：3: 2013年; 获得了一类茶树氧甲基转移酶基因cDNA全长并构建了该基因的原核表达载体。以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得氧甲基转移酶(O-methyltransferase)基因cDNA全长1 280 bp,其开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸,推测的蛋白分子量为39.1 kD,理论等电点为5.68。其氨基酸序列与葡萄和蓖麻氧甲基转移酶基因相似性分别为73%、71%。将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21后诱导重组蛋白的表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到1条与预测融合蛋白分子量相符的外源蛋白。; 马成英施江吕海鹏张悦谭俊峰郭丽彭群华林智; 关键词：茶树克隆原核表达

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国家自然科学基金(30972404)