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原料乳中多种致病菌的快速过滤富集及多重PCR检测被引量：10: 2008年; 针对目前原料乳中致病菌的检测方法繁琐费时耗力的缺点,建立一种能同时检测原料乳中多种致病菌的快速检测方法,采用多重PCR快速灵敏检测技术与一种不需要预增菌就可以直接从原料乳中快速过滤富集菌体的技术相结合来同时检测原料乳中主要致病菌——沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌和蜡样芽孢杆菌。整个过程只需7～8h即可完成,且检测灵敏度可达102cfu/mL。这种方法是对传统检测方法的有效改进,并且达到了原料乳检测快速、准确、灵敏的要求。; 吕琦赵凤毕宇涵张光辉周艳秋遇晓杰张剑峰姜毓君; 关键词：多重PCR 原料乳致病菌

金黄色葡萄球菌基因表达的DNA扣除法Real-time RT PCR相对定量分析被引量：6: 2008年; 【目的】金黄色葡萄球菌作为一种分布广泛的致病微生物和研究革兰氏阳性菌遗传背景的模式菌株,利用real-time RT PCR对相关毒素及调控基因进行表达定量分析,在生物、医学、食品检测等领域具有较大研究价值。【方法】对制备好的反转录(RT,含有cDNA和DNA)和非反转录(RT—,仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测,根据经典(1+E)—△△Ct相对定量算法并结合PCR效率公式建立一种基因表达相对定量分析的DNA扣除法,将得到的Ct值转换为各样品含量,从RT样品中扣除RT—样品的量,无需DNaseⅠ酶解处理就可以去除DNA的影响,RT—样品的检测结果还可同时作为稳定的DNA内参。【结果】采用以上方法分析金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)、16S rRNA和RNAⅢ的表达情况,在含有葡萄糖的NB培养基中sea的相对转录水平随着葡萄糖浓度的增大而升高,RNAⅢ的相对转录水平随葡萄糖浓度的变化而产生小幅度的波动,16S rRNA在菌体生长初期时的表达量较为稳定;与绝对定量法比较,结果差异较小(均小于15%),且差异不显著(p>0.05)。【结论】这种基于DNA扣除法的Real-time RT PCR相对定量方法可以有效的对金黄色葡萄球菌的基因表达进行分析。; 相丽姜毓君刘伟毕宇涵赵凤霍贵成; 关键词：金黄色葡萄球菌 PCR 内参

实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌被引量：18: 2008年; 单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌。为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性。结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应。单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml。而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml。人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml。此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查。; 闫冰姜毓君曲妍妍毕宇涵相丽赵凤; 关键词：实时RT-PCR 单增李斯特菌活菌

乳酸菌风味代谢物质的基因调控被引量：21: 2007年; 乳酸菌的主要风味代谢物质包括丁二酮,乙醛以及各种氨基酸。利用基因工程和代谢工程的相关技术提高乙醛和丁二酮产量,是当前乳酸菌研究的热点之一。乙醛的代谢调控主要是针对丝氨酸羟甲基转移酶的表达进行调控,或是针对丙酮酸脱羧酶和NADH氧化酶的表达采用联合调控策略;而丁二酮的代谢调控则主要集中于乳酸脱氢酶、NADH氧化酶、α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶中任意两种关键酶基因间的联合调控,并且存在进行乳酸脱氢酶,α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶3种关键酶基因联合调控的可行性。; 韩希妍孙大庆相丽霍贵成姜毓君; 关键词：乳酸菌基因调控乙醛丁二酮

Taqman探针实时PCR检测金黄色葡萄球菌的研究被引量：1: 2008年; 建立了Taqman探针实时PCR方法,针对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。研究所设计的引物具有良好的特异性,而且Taqman探针实时PCR方法检测sea基因的灵敏度高,最低检出限为69 fg,并且该方法可在8 h内完成人工污染乳中金黄色葡萄球菌的检测,最低检出限为83 cfu/mL。研究所建立的方法具有特异性强、灵敏性高及操作简便等优点,适宜于牛乳中金黄色葡萄球菌污染的调查及监测。; 李一松韩希妍赵凤曲妍妍周艳秋李彬姜毓君; 关键词：TAQMAN 实时PCR 牛乳金黄色葡萄球菌

SYBR Green I荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究被引量：17: 2008年; 金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。; 李一松王明娜吕琦张光辉闫冰相丽姜毓君; 关键词：金黄色葡萄球菌荧光定量PCR SEA基因 SYBR

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因被引量：12: 2009年; 金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,尤其是肠毒素。国内外由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒屡屡发生。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素仍采用传统的方法,其操作繁琐、检测时间较长,通常需要3-5 d才能完成,且灵敏度较低。本研究缩短食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测时间,针对PCR检测的灵敏性、特异性,建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法,为检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素提供了技术支持。分别采用TRIZol法和热酚法提取金黄色葡萄球菌总RNA并进行比较研究,在此基础上反转录获得cDNA,用特异引物对sea基因进行扩增,并优化PCR反应条件,获得理想的sea基因阳性扩增条带。结果表明,热酚法在总RNA提取方面优于TRIZol法,改进PCR反应时间和循环次数,最终初步建立RT-PCR检测金黄色葡萄球菌A基因的方法。; 姜毓君李一松相丽毕宇涵赵凤; 关键词：金黄色葡萄球菌 SEA基因 RT-PCR

原料乳中沙门氏菌的快速过滤富集及PCR检测被引量：12: 2007年; 尽管国内外以PCR技术为基础对食源性致病菌的检测手段已经基本成熟,但是由于大多数有8～12h的预增菌步骤,从而增加了检测时间和检测成本。建立了对原料乳中沙门氏菌的快速、简单、灵敏PCR检测技术。人工污染沙门氏菌的原乳,先离心脱脂,然后添加Na2EDTA获得澄清乳液,最后通过0.45μm微膜过滤收集菌体。整个PCR检测过程可在6.5h以内完成,且检测灵敏度可达到1～10mL-1。该方法值得推广,应用于原乳中该食源致病菌的日常检测。; 刘伟姜毓君吕琦王明娜闫冰孙大庆; 关键词：沙门氏菌 PCR

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黑龙江省科技攻关计划(GA06C101-08)

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