重庆市自然科学基金(2005BB5029)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- 甘氨酸/丝氨酸置换146位半胱氨酸对sBAFF功能的影响
- 2006年
- 目的探讨甘氨酸/丝氨酸置换146位半胱氨酸对sBAFF功能的影响,为深入探讨sBAFF的功能和机制奠定基础。方法采用一步反向PCR法,将编码sBAFF第146位半胱氨酸(Cys)的核苷酸序列置换为甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的编码序列,测序正确后,亚克隆到高效原核表达载体pQE80L;以IPTG诱导表达,SDSPAGE和Westernblot检测表达产物,Ni2+NTA柱层析纯化目的蛋白;最后经MTT法检测其促B淋巴细胞增殖活性。结果经一步反向PCR扩增后均得到459bp的DNA片段,经测序分析表明分别为sBAFF第146位半胱氨酸残基点突变为甘氨酸和丝氨酸的序列,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。活性检测证实其能明显刺激B淋巴细胞系Raji细胞增殖,与正常sBAFF相比,置换为丝氨酸后活性升高,置换为甘氨酸后活性无明显改变。结论在原核表达时,通过置换146位半胱氨酸为丝氨酸可明显提高sBAFF的活性,为进一步探讨sBAFF的功能机制奠定了基础。
- 黄刚何凤田李蓉芬高会广陈麟凤张立胡大强
- 关键词：CDNA克隆蛋白纯化细胞活化
