国家高技术研究发展计划(2001AA215321)
- 作品数：13 被引量：41H指数：3
- 相关作者：郝晓柯苏明权刘家云易静岳乔红更多>>
- 相关机构：第四军医大学西京医院第四军医大学第四军医大学唐都医院更多>>
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- 羧肽酶A1全酶及其肽段基因的克隆及分泌表达被引量：2
- 2008年
- 目的:克隆人羧肽酶A1(CPA1)全酶及其4条肽段基因,构建重组表达载体,并在COS-7细胞中分泌表达.方法:以胰腺总RNA为模板,RT-PCR扩增CPA1全酶基因;再以全酶基因为模板,PCR扩增其4条肽段基因;扩增产物分别克隆于分泌表达载体pFLAG-CMV-1中构建重组载体;然后用脂质体转染COS-7细胞,分泌表达融合FLAG-tag的目的蛋白和肽段;点印迹法检测目的蛋白的表达.结果:获得了CPA1全酶及其4条肽段基因,构建了重组表达载体,测序证实插入序列正确,并在COS-7细胞中成功分泌表达了融合FLAG-tag的目的蛋白和肽段.结论:在COS-7细胞成功分泌表达了融合FLAG-tag的CPA1全酶及其4条肽段,为下一步酶活性测定奠定了基础.
- 卢雪涛岳乔红刘家云马越云苏明权郝晓柯
- 关键词：肽类COS-7细胞分泌表达
- 血管内皮生长因子及其受体KDR在前列腺癌细胞中的表达研究
- 2005年
- 目的：探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(KDR)在前列腺癌细胞中的表达及意义。方法：免疫细胞化学和Western blot检测体外培养的LNCaP,PC-3,PC-3M,DU-145和22RV1前列腺癌细胞中VEGF及其受体KDR的蛋白表达,RT-PCR检测mRNA,ELISA检测前列腺癌细胞培养上清VEGF蛋白含量。结果：免疫细胞化学染色显示VEGF和KDR在前列腺癌细胞LNCaP,PC-3,PC-3M,DU-145和22RV1中均有表达,但表达水平略有差别。LNCaP,PC-3和DU-145细胞中VEGF和KDR蛋白表达及其mRNA的含量显著高于PC-3M和22RV1(P<0．01)。细胞培养上清中VEGF蛋白含量结果与免疫细胞化学染色结果相同。结论：VEGF及其受体KDR在前列腺癌细胞中的表达量不近相同,但二者的表达对研究前列腺癌的发生发展及其机理有重要意义。
- 缪应业刘家云苏明权沈建军郝晓柯
- 关键词：血管内皮生长因子KDR前列腺癌
- 人γ-精浆蛋白的亲和纯化及其糖基化分析被引量：1
- 2007年
- 目的:从人精液中提纯γ-精浆蛋白并对其生物学特性进行鉴定。方法:应用饱和硫酸铵法从小鼠腹水中纯化出抗γ-精浆蛋白的单克隆抗体E4B7,将其共价交联到CNBr-Sepharose4B上,制备成免疫亲和层析柱,用该层析柱亲和纯化经饱和硫酸铵粗提的精液标本。纯化产物分别用SDS-PAGE、Western-blot及ELISA进行生物学特性鉴定,最后经PNGaseF、Endo-H酶消化后进行糖基化分析。结果:SDS-PAGE电泳表明纯化蛋白的相对分子量约为44kDa,Western-blot及ELISA鉴定显示该蛋白可与抗γ-精浆蛋白的单抗E4B7特异性结合。对纯化蛋白无论是单用Endo-H酶消化,还是同时用Endo-H酶和PNGaseF酶共同消化,消化产物电泳后相对分子量均降低到34kDa左右,而单独用PNGaseF酶消化后相对分子量没有改变。Western-blot及ELISA鉴定显示糖苷酶处理后的纯化蛋白仍可与单抗E4B7特异性结合。结论:成功纯化出N-糖基化形式的γ-精浆蛋白,这为下一步筛选人源化抗体奠定了纯的抗原基础。
- 张青张思河苏明权沈建军韦晓明郝晓柯
- 关键词：糖基化
- KDR siRNA表达载体的构建和鉴定被引量：2
- 2006年
- 目的构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体(KDR)的pSilencerTM3.1siRNA(smallinterferingRNA)表达载体,并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果.方法设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1-H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定.以脂质体法将pSilencerTM3.1-H1neo空载体和3个(pSilencer3.1-KDR1,pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系.72h后用RT-PCR和Westernblotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDRmRNA及蛋白水平的表达情况.结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDR-siRNA的前列腺癌细胞,72h后,而以pSilencer3.1-KDR3的抑制KDRmRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率约为55%.结论成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-KDR1,pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3,pSilencer3.1-KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达,为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.
- 缪应业刘家云易静苏明权沈建军郝晓柯
- 关键词：血管内皮生长因子受体2
- 用亲和层析法纯化人精浆蛋白
- 2006年
- 【目的】用亲和层析法从增生的前列腺组织中纯化人精浆蛋白(-γseminoprotein,-γsm)。【方法】采用超声波粉碎、NP-40提取与两种免疫亲和层析相结合[抗人精浆蛋白单抗(E4B7mAb)亲和层析和蛋白A亲和层析]的新提纯方案,获得了高纯度-γsm抗原。【结果】所纯化的-γsm蛋白经ELISA双抗夹心法和免疫印迹分析检测证明,用此法从增生的前列腺组织中分离到-γsm抗原,而且纯化的-γsm具有生物活性。【结论】这种方法的建立将为分离-γsm抗原提供一种有效途径,为抗精浆蛋白基因工程抗体的研究提供良好的抗原保证。
- 孙脊峰杨洁郝晓柯金明赵晶王成济杨安钢
- 关键词：纯化
- siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达被引量：2
- 2008年
- 目的:构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(KDR)基因的shRNA表达载体,研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响.方法:将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencerTM3.1-H1neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,构建pSilencer3.1-KDR1,pSi-lencer3.1-KDR2和Psilencer3.1-KDR3三个siRNA表达载体.经酶切及DNA测序鉴定后,采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化,流式细胞仪检测细胞周期的变化,以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1-NC的PC3细胞为对照.结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明,pSilencer3.1-KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA,下调蛋白表达;转染pSilenc-er3.1-KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢.结果表明,pSi-lencer3.1-KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高,而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01).而pSilencer3.1-KDR1和pSilencer3.1-KDR2无效.结论:成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体,只有pSilencer3.1-KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达,抑制PC3细胞的增殖.
- 缪应业刘新李浩乔卿华侯林虎刘小圆郝晓柯
- 关键词：血管内皮生长因子受体PC3细胞前列腺肿瘤
- 人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达被引量：2
- 2006年
- 目的应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白。方法从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白。结论在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础。
- 易静刘家云缪应叶张青苏明权岳乔红郝晓柯
- 关键词：巴斯德毕赤酵母基因表达
- 抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达
- 2004年
- 目的 获得鼠抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)克隆Fd段和κ链基因 ;构建到噬粒pComb3中 ;并用ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析证明表达的Fab段特异性结合人精浆蛋白。结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞系E4B7中克隆出了重链Fd段和κ链基因 ,经序列测定表明 ,Vκ 属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族 ,VH与鼠免疫球蛋白MUSIGHAEI同源性最高。将该Fd和κ链基因克隆到表达载体pComb3中 ,在大肠杆菌中获得了表达。结论 ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析表明 。
- 杨洁郝晓柯孙脊峰赵晶于翠娟许彦鸣金明王成济杨安钢
- 关键词：单克隆抗体FAB段基因表达
- 肿瘤的酶-前药疗法被引量：1
- 2005年
- 药物在肿瘤部位的低浓度及系统毒性仍是干扰肿瘤治疗的因素之一。酶-前药疗法将酶的高效性与前药的低毒性相结合,开辟了肿瘤治疗的新领域。现综述酶-前药疗法的分类、原理、应用现状及前景。
- 易静郝晓柯苏明权
- 关键词：酶类肿瘤
- 粘附分子CD146是影响滋养层细胞侵入行为的关键分子被引量：7
- 2004年
- 前期研究观察到一种现象 ,在正常妊娠的胎盘中细胞粘附分子CD14 6选择性地表达在侵入性滋养层细胞中 ,而在滋养层细胞侵入不足的先兆子痫病人的胎盘中CD14 6表达降低或缺失 .本文进一步研究了CD14 6分子影响滋养层细胞侵入行为的作用机理 .免疫荧光实验显示CD14 6分子选择性地表达在具有侵袭能力的中间滋养层细胞 ,而在非侵入性的细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞中不表达 .细胞功能实验表明 ,影响滋养层细胞侵入性的两个关键要素 ,即细胞迁移和基质金属蛋白酶的分泌 ,都受到CD14 6特异抗体的显著抑制 .这些研究结果提示 ,粘附分子CD14 6是影响细胞侵入行为的关键分子 .这为深入研究胚胎植入和肿瘤浸润的分子调控机理提供了一个关键的分子模型 .
- 刘琴赵心刚张莹沈毅刘以训阎锡蕴
- 关键词：细胞粘附分子基质金属蛋白酶
