国家高技术研究发展计划(2001AA215201)
- 作品数：8 被引量：39H指数：5
- 相关作者：柏银兰徐志凯薛莹师长宏张海更多>>
- 相关机构：第四军医大学复旦大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究被引量：11
- 2003年
- 目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。
- 范雄林徐志凯李元李别虎薛莹柏银兰白光春贾向志
- 关键词：结核分枝杆菌AG85B基因疫苗免疫保护作用
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的克隆表达及纯化被引量：3
- 2005年
- 获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pPROEXTM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28 kD的esat6-cfp10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。
- 张海师长宏范雄林薛莹柏银兰姜泓高雪徐志凯
- 关键词：ESAT6CFP10融合基因结核分枝杆菌
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达被引量：5
- 2005年
- 目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点 亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定 正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT PCR方法检测 mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果:PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致,大小约为 350bp.重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合 esat6 cfp10基因片段.RT PCR可获得大小约为350bp的 cfp10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6 Cfp10蛋白的阳 性细胞着染.结论:成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因,构建 了融合有esat6 cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行 了表达.
- 张海师长宏薛莹姜泓高雪柏银兰王丽梅徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT6CFP10基因疫苗真核表达
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因稳定表达细胞系的建立被引量：5
- 2005年
- 目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型。方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,多轮筛选过后分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA610,RT-PCR结果证明esat6-cfp10融合基因已稳定整合在转染P815细胞染色体上,间接免疫荧光检测后表达有ESAT6-CFP10蛋白的阳性细胞着染。结论获得了稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测结核杆菌DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础。
- 张海薛莹姜泓高雪师长宏柏银兰王丽梅徐志凯
- 关键词：分枝杆菌结核ESAT6CFP10
- 分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选被引量：6
- 2005年
- 目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌(E.coli.)BCG穿梭载体pOLYG中,构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22,按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体,分别命名为pDE22Ag85B ESAT6和pDE22ESAT6Ag85B,将纯化的重组质粒电穿入BCG,经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液,经浓缩和透析后,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western blot法)分析。结果两株重组BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白,且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。
- 师长宏徐志凯朱德生李元柏银兰薛莹
- 关键词：AG85B重组卡介苗WESTERN-BLOT法重组BCG分泌表达载体H37RV
- 表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性被引量：10
- 2007年
- 目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次.末次免疫结束2wk后,检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN-γ和IL-2水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠以1×105MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击,4wk后计数脾脏细菌负荷数,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶800.淋巴细胞刺激增殖指数为2.42±0.13,显著高于生理盐水对照组;免疫小鼠诱导IFN-γ含量(2449±12)ng/L与卡介苗(BCG)组无明显差异,IL-2含量(198±16)ng/L不及BCG免疫组,但显著高于生理盐水对照组;同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42%.与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.51±0.23,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少.结论:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用.
- 张海师长宏王丽梅薛莹柏银兰徐志凯
- 关键词：分枝杆菌疫苗ESAT6CFP10融合蛋白免疫原性
- ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达被引量：4
- 2006年
- 目的:构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的重组载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌。PCR筛选到的阳性克隆经温度诱导后,SDS-PAGE和Western印迹检测表达蛋白的正确性。结果:可表达出相对分子质量约23000的ESAT6-CFP10融合蛋白。Western印迹证明重组蛋白有较好的免疫原性。结论:获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,为结核病的预防奠定了一定的基础。
- 张海师长宏李羽薛莹柏银兰王丽梅高雪姜泓徐志凯
- 关键词：耻垢分枝杆菌重组疫苗
- 结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤酵母中的融合表达及其活性研究
- 2004年
- 为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α 2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat 6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K α2a esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD116 8中 ,采用G4 18梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵 4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 。
- 刘林赵志安王洪海宋大新
- 关键词：分泌型载体
