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猪对PRRSV易感性差异的研究进展被引量：4: 2010年; 猪繁殖与呼吸综合征是当前危害养猪业最严重的传染病之一,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)。由于PRRSV的不断变异,其感染力和致病力增强,现有疫苗的保护效果不佳,且弱毒活疫苗有变异成新强毒的风险。本文从宿主遗传变异的角度讨论猪对PRRSV的易感性,包括猪免疫应答的变异与易感性、猪对PRRSV易感性的品种(系)间差异以及PRRSV抗性育种亟待解决的问题,试图为PRRS的防制提供新的思路。; 丰秀静曹少先孟春花孟春花刘铁铮; 关键词：PRRSV DIFFERENCES 猪繁殖弱毒活疫苗抗性育种致病力

猪APOBEC3F基因真核表达载体的构建及其在MARC145细胞中的表达定位被引量：2: 2015年; 载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3F(APOBEC3F)属固有免疫系统中的重要成员,对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等多种病毒的复制具有广泛的抑制作用。为构建APOBEC3F基因的真核表达载体,并检测其在体外培养的MARC145细胞中的表达情况,通过RT-PCR从猪脾脏组织扩增APOBEC3F基因,定向克隆到表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体p EGFP-CMV中,构建p EGFP-APOBEC3F。PCR扩增及测序显示,APOBEC3F插入载体位置、方向及序列均正确。p EGFP-APOBEC3F经脂质体介导法转染MARC145细胞,转染后24 h APOBEC3F m RNA的水平升至最高。细胞免疫化学法检测发现APOBEC3F蛋白主要在MARC145细胞质中表达。研究结果为体外研究猪APOBEC3F基因在抗猪蓝耳病中的作用奠定了基础。; 孟春花王春玲李静心李隐侠朱前明曹少先; 关键词：真核表达载体转染荧光定量PCR 脂质体

猪SLA-DRB1基因外显子3单核苷酸多态性及其与PRRSV易感性的关联: 2016年; SLA-DRB1是影响猪体免疫反应、疾病感染和疫苗应答的重要因子。本研究对猪SLA-DRB1基因外显子3序列进行扩增和测序,筛选多态性位点,分析其与PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)易感性的相关性。测序发现SLA-DRB1基因外显子3存在4个单碱基突变(g.17G/A、g.95C/T、g.137G/C和g.232G/C)。针对g.232G/C建立PCR-RFLP方法,检测6个猪种群共227个样本,发现在大白姜曲海杂交猪、姜曲海猪、长白猪、定远猪和杜洛克猪中有GG(0.43,0.80,0.59,0.54,0.83)和GC(0.57,0.20,0.41,0.46,0.17)2种基因型,其他群体均为GG型。不同基因型猪肺泡巨噬细胞中PRRSV拷贝数在接毒后6、12、18、24、36 h差异均不显著(P>0.05),不同基因型猪血液中病毒载量在接毒后4、7、11、14、21、28、35、42 d差异均不显著(P>0.05),不同基因型对猪体质量和日增质量的影响不显著(P>0.05)。提示SLA-DRB1的g.232G/C突变与PRRSV抗性无显著关联。; 漫晓丹孟春花王慧利李隐侠李齐发曹少先; 关键词：外显子 PCR-RFLP 易感性碱基突变

锌指核酸酶技术在基因组定点修饰中的应用被引量：4: 2013年; 锌指核酸酶已作为一种基因组编辑工具成功应用于多种有机体及细胞类型。它包括一个非特异的FokⅠ核酸内切酶DNA切割结构域和一个特异性的DNA结合结构域。可以在基因组定点产生双链断裂,并通过细胞对基因组DNA的自我修复途径使基因打靶效率提升几个数量级。当包含该位点同源区的外源DNA存在时发生同源重组修复,实现外源基因的定点敲入,无同源DNA存在时通过非同源末端连接途径产生基因突变。在锌指核酸酶技术出现前,基因打靶动物的生产主要是依靠ES细胞系上的同源重组技术或核移植基础上的克隆技术,但仅限于极少数物种。本文简要介绍这一技术作用原理和设计方法,以及它在疾病治疗,模式动物研究和动物生物反应器方面的最新研究进展,旨在展示锌指核酸酶技术的广阔前景。; 张庆晓曹少先苏磊王慧利孟春花王锋; 关键词：锌指核酸酶同源重组

PRRSV非结构蛋白与病毒逃逸宿主免疫反应的机制: 2014年; 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是当今养猪业面临的最严重的病毒病原体之一。病毒在猪群中持久存在给控制和消除该疾病带来了挑战。其持久存在的生理基础包括逃逸宿主的先天性免疫和适应性免疫应答,而抑制Ⅰ型干扰素的产生是主要途径。本文主要阐述PRRSV通过非结构蛋白(NSP)干扰RIG-Ⅰ/MDA5等信号通路,抑制Ⅰ型干扰素产生,逃避宿主免疫反应的机制。; 王亚磊茆达干孟春花李静心曹少先; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白免疫逃逸

猪PRRS抗性筛选单核细胞来源巨噬细胞模型的建立: 2013年; 采用密度梯度离心法分离猪外周血单核细胞(PBMCs),通过添加GM-CSF刺激使PBMCs转化为外周血单核细胞来源巨噬细胞(MDMs);比较了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染MDMs和肺泡巨噬细胞(PAMs)不同时间的病毒载量及病毒TCID50,研究了PRRSV体外感染猪MDMs后复制和滴度的变化规律。结果表明:PBMCs转化的MDMs具有很好的墨汁吞噬能力,MAC387标记阳性;GM-CSF刺激PBMCs转化为MDMs的最适质量浓度为20 ng.mL-1,刺激时间为72 h时MDMs转化率最高;PRRSV体外感染12 h时MDMs中病毒载量达到最高值,随后迅速下降;细胞上清液的病毒滴度在12～24 h进入平台期,然后转入衰亡期,与PRRSV在PAMs中增殖趋势相似。本试验建立的PRRS抗性筛选MDM模型,具有受检猪只损伤小、简便易行的特点,可代替PAM细胞模型用于评价猪对PRRS的抗性。; 孟春花贺强苏磊李静心王慧利刘铁铮舒邓群曹少先; 关键词：抗性

猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究被引量：5: 2012年; 通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),优化了PAM的纯化和冷冻保存方法,并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。结果表明:RPMI-1640培养液比DMEM培养液更适于PAM的培养和冷冻保存;巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明,贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度最高(P<0.05);用70%RPMI-1640+20%新生牛血清+10%DMSO的体系冷冻保存细胞密度为1×107个/mL的PAM可获得高达98.09%的存活率,冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P>0.05)。; 孟春花曹少先苏磊贺强王慧利丰秀静张庆晓刘铁铮; 关键词：肺泡巨噬细胞纯化冷冻保存

电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化被引量：3: 2012年; 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响。结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著。不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率。质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8%。; 张庆晓王慧利孟春花王锋曹少先; 关键词：胎儿成纤维细胞电穿孔转染增强型绿色荧光蛋白

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国家自然科学基金(30972075)