国家自然科学基金(30972083)
- 作品数：10 被引量：34H指数：4
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- 原核表达梅花鹿IGF-1成熟多肽对鸡CEF和CEK细胞增殖的影响被引量：1
- 2015年
- 本实验利用原核表达载体pET-30a对梅花鹿胰岛素样生长因子-1(Insulin Growth Factor,IGF-1)成熟多肽基因进行诱导表达与纯化,经羟胺裂解和复性后获得重组梅花鹿IGF-1成熟多肽蛋白。再通过MTT法检测重组蛋白IGF-1对鸡胚成纤维细胞(Chick Embryo Fibroblast,CEF)及鸡胚肾细胞(Chicken Embryo Kidney,CEK)增殖的影响。MTT法检测结果发现不同浓度的重组IGF-1成熟多肽皆能促进鸡胚成纤维细胞的增殖,其中,在48 h、终浓度为200 ng/m L时对鸡胚成纤维细胞增殖的影响最显著。但不同浓度的重组IGF-1成熟多肽以及不同处理时间对鸡胚肾细胞增殖均无显著影响。本研究结果说明原核表达的IGF-1成熟多肽可显著促进鸡胚成纤维细胞的增殖,但对鸡胚肾细胞的增殖影响不显著。
- 胡薇牛永梅司博王蒙蒙闫语多
- 关键词：梅花鹿原核表达鸡胚成纤维细胞增殖
- 鹿茸顶端组织IGF1R基因的部分cDNA克隆及差异表达被引量：3
- 2011年
- 为了研究梅花鹿鹿茸顶端组织IGF1R基因的表达水平,采用TRIzoL试剂分别提取鹿茸真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层总RNA,以逆转录酶AMV反转录合成cDNA,根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGF1R基因特异引物并克隆IGF1R基因,最后利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGF1R基因在鹿茸顶端不同部位组织的表达差异。研究结果表明:试验成功克隆到1 203 bp的IGF1R基因序列,该序列包含IGF1R基因的部分编码序列,并编码401个氨基酸长度的多肽;与GenBank中的牛、猪、人和小鼠IGF1R基因进行比对分析,梅花鹿IGF1R基因与牛、猪、人和小鼠IGF1R核苷酸同源性分别为98%、94%、93%和88%;IGF1R蛋白氨基酸序列同源性分别为98.3%、98.5%、97.8%和94.5%。对荧光定量PCR的差异分析发现,IGF1R基因在鹿茸顶端间充质层、真皮层、前软骨层和软骨层存在明显的上调表达现象。
- 胡薇孟星宇田玉华刘宁
- 关键词：鹿茸胰岛素样生长因子1受体CDNA克隆差异表达分析
- 梅花鹿IGF-1的原核表达与纯化被引量：6
- 2012年
- 【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Rosetta大肠杆菌进行诱导表达(0.6mmol/L IPTG,37℃,4h)后,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。用Ni-Agarose柱亲和层析试剂盒分离、羟胺裂解纯化目标蛋白,并利用四唑盐比色法(MTT法)和流式细胞仪检测目标蛋白对NIH3T3细胞增殖及不同细胞周期下NIH3T3细胞比例的影响。【结果】获得了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列(234bp);经鉴定,原核表达载体pET-32a-IGF-1构建成功;SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在Rosetta中成功诱导表达了融合蛋白,且羟胺裂解纯化后的目的蛋白纯度较高;MTT法和细胞周期检测结果表明,复性后的IGF-1重组蛋白能促进细胞增殖。【结论】成功克隆了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列,获得了具有生物学活性的IGF-1蛋白。
- 孟星宇李婷李沐刘宁田玉华胡薇
- 关键词：梅花鹿胰岛素样生长因子1蛋白纯化生物学活性
- 梅花鹿IGF1全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达被引量：9
- 2011年
- 为了检测梅花鹿鹿茸组织IGF1基因的mRNA表达水平,利用TRIzol试剂法分别提取鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA,逆转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGF1基因特异引物并克隆IGF1基因,将IGF1基因DNA序列递交GenBank,并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGF1在鹿茸顶端不同部位组织的转录表达丰度。研究结果表明:成功获得了梅花鹿鹿茸组织IGF1基因全长编码区cDNA(GenBank登录号为HQ890468),该基因长465 bp,编码154aa长度的多肽;与马鹿、牛、羊、马、猪、人和小鼠IGF1基因进行同源性分析显示,IGF1基因与马鹿、牛和羊同源性最高,核苷酸序列分别为99.78%、98.28%和97.85%;氨基酸序列分别为99.35%、98.05%和97.40%。相对荧光定量PCR差异分析发现,IGF1基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中,在前软骨和软骨组织的表达水平明显高于真皮和间充质组织。
- 胡薇孟星宇田玉华刘宁
- 关键词：梅花鹿胰岛素样生长因子1CDNA克隆荧光定量
- 鹿茸细胞生长因子的研究进展
- 梅花鹿或马鹿的鹿茸不仅是哺乳动物肢体再生领域一种理想的研究模型,也是独一无二的再生哺乳动物器官。细胞生长因子在鹿茸快速生长过程中起到重要的作用。本文对胰岛素生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生...
- 吴炎牛永梅司博王蒙蒙胡薇
- 关键词：梅花鹿马鹿鹿茸细胞生长因子生长发育
- 文献传递
- microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响被引量：7
- 2013年
- 【目的】构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1基因(IGF1)的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响。【方法】根据IGF1mRNA序列设计并合成4对premicroRNA前体片段,定向克隆于pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-4;测序分析插入序列的完整性,将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1蛋白的表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响。【结果】测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确。转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1mRNA的表达水平均有所下降,其中转染重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,因而筛选重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2为最佳干扰质粒。与对照组相比,IGF1蛋白的表达水平降低;重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期。【结论】梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中,miRNA具有重要的调控作用。
- 李婷李沐孟星宇刘宁胡薇
- 关键词：胰岛素样生长因子1基因沉默
- 梅花鹿成熟型TGF-β1基因的克隆与结构分析及其在鹿茸顶端组织中的表达被引量：4
- 2020年
- 为探究细胞因子对鹿茸再生的影响,提取鹿茸顶端组织总RNA(Trizol法),反转录获得cDNA模板,克隆TGF-β1成熟肽基因。利用生物信息学软件,对其基因序列及蛋白质结构进行分析。结果表明:成功获得梅花鹿TGF-β1成熟肽基因,序列长339 bp,共编码112个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为12.8 kD。同源性分析结果显示,TGF-β1在进化过程中具有高度保守性,梅花鹿与牛、羊、猪、人、鼠的核苷酸序列同源性均>90%;除鼠外,梅花鹿与其他物种氨基酸序列并未发生变化。免疫组化结果显示,TGF-β1在鹿茸顶端不同组织中差异表达,软骨层中表达水平最高。由此推测,TGF-β1在鹿茸再生过程中可能发挥重要作用。
- 刘明晓韩香玉刘洪运胡薇
- 关键词：梅花鹿转化生长因子Β1基因克隆免疫组化
- 鹿茸细胞生长因子的研究进展被引量：8
- 2015年
- 梅花鹿或马鹿的鹿茸不仅是哺乳动物肢体再生领域的一种理想的研究模型,也是独一无二的再生哺乳动物器官。细胞生长因子在鹿茸快速生长过程中起着重要作用。文章对胰岛素生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子在鹿茸再生发育过程中的作用进行了简要综述。
- 吴炎牛永梅司博王蒙蒙胡薇
- 关键词：梅花鹿马鹿鹿茸细胞生长因子生长发育
- MiRNA-93-5p对VEGF的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系被引量：3
- 2014年
- 为了探讨miRNA-93-5p对梅花鹿血管内皮生长因子(VEGF)的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,分离了鹿茸顶端软骨组织细胞,利用Trizol试剂法提取细胞总RNA,反转录合成c DNA。根据Gen Bank已发表的相关序列设计梅花鹿VEGF基因的3'端非编码区部分序列(3'UTR)特异引物并进行克隆,构建VEGF基因的3'UTR野生型及其突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测。再将人工合成的miRNA-93-5p模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测鹿茸细胞体外增殖的变化;Western blotting分析VEGF蛋白的表达丰度。结果表明:成功获得了鹿茸组织VEGF基因的3'UTR序列,野生型序列长度为356 bp,突变体长度为336bp。荧光素酶活性检测结果表明,转染野生型质粒组细胞荧光素酶活性降低,而转染突变体组细胞荧光素酶活性无明显变化。MTT法和Western blotting结果显示,鹿茸细胞的体外增殖受到抑制,VEGF蛋白的表达水平下降,且呈时间依赖性。
- 李璐李婷李沐吴炎齐琳崔东明胡薇
- 关键词：血管内皮生长因子转录调控细胞增殖
- 鹿茸顶端组织端粒酶活性检测及TERT基因的差异表达
- 2013年
- 为了检测梅花鹿鹿茸顶端组织不同部位的端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(TERT)基因的mRNA表达水平,分离鹿茸顶端组织的茸皮层、间充质层及软骨层,并进行细胞培养,利用TRAP银染法测定不同部位的端粒酶活性。再利用TRIzol试剂法分别提取茸皮层、间充质和软骨细胞的总RNA,逆转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿TERT基因部分序列特异引物并克隆TERT基因,采用相对荧光定量Real-time PCR法检测TERT在鹿茸顶端不同部位细胞的表达丰度。结果表明:在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层均检测到了端粒酶活性,其中间充质层的端粒酶活性最高,软骨层次之,茸皮层端粒酶活性最低;而体外培养的不同代数间充质细胞的端粒酶活性无明显差异。成功获得了鹿茸组织TERT基因部分编码区cDNA序列,该基因长915 bp,编码305个AA;与牛、羊TERT基因进行同源性分析显示,核苷酸序列分别为94.89%和94.31%;氨基酸序列分别为92.16%和92.11%。相对荧光定量PCR差异分析发现,TERT基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中,在间充质组织的表达水平高于软骨和茸皮层组织。
- 胡薇李沐李婷田玉华孟星宇刘宁
- 关键词：梅花鹿端粒酶端粒酶逆转录酶荧光定量
