博士科研启动基金(6631024)
- 作品数：6 被引量：24H指数：3
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- 华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、序列分析及表达被引量：9
- 2012年
- 丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶,为了了解该类酶的分子特性及功能,本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库,首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列,命名为HoSP1(GenBank登录号为FJ573146)。序列分析表明,该基因长902bp,开放阅读框(ORF)长783bp,编码260个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.7kDa和4.19,不含有N-糖基化位点,但在Thr157处有一个O-糖基化位点,含有6个保守的半胱氨酸残基,组成3对二硫键,对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现,该酶具有组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)催化中心,与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性,其中与CzSP3的序列一致性最高,为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后,进行体外表达,以BTEE为底物,测得该酶的活力为0.0378μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。
- 刘海明郑桂玲李长友周洪旭
- 关键词：华北大黑鳃金龟CDNA表达文库丝氨酸蛋白酶体外表达
- 荧光增白剂与增效蛋白对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)的增效作用被引量：8
- 2013年
- 围食膜是昆虫中肠细胞与肠腔之间的一种防御性屏障,破坏围食膜即能促进病原微生物对昆虫的侵染。分别研究了荧光增白剂FB28和棉铃虫Helicoverpa armigera颗粒体病毒增效蛋白(En-Ha)对美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HcNPV)的增效作用,分析了活体条件下FB28与En-Ha对美国白蛾幼虫围食膜的破坏作用,解释了其增效作用机理。生物测定结果表明,FB28和En-Ha均能够影响围食膜蛋白的表达谱,提高HcNPV的感染率,使其毒力显著提高:单独饲喂HcNPV时的LC50值为1.11×105PIBs/mL,添加FB28和En-Ha后,其LC50值分别降低为1.91×103和7.70×103PIBs/mL,增效比值(SR)分别为58.12和14.42。SDS-PAGE电泳结果发现:用FB28饲喂处理幼虫后,分子质量为60 ku的蛋白条带消失,37 ku的新蛋白条带逐渐出现;幼虫摄取含有En-Ha的饲料后,分子质量为75 ku的蛋白条带消失,44.3 ku的新蛋白条带逐渐出现。经过10～24 h后,FB28和En-Ha处理的幼虫围食膜都能够恢复正常,表明其破坏作用是短暂的。
- 刘海明周洪旭李长友
- 关键词：荧光增白剂增效蛋白美国白蛾围食膜核型多角体病毒
- 美国白蛾中肠cDNA表达文库的构建与鉴定被引量：1
- 2014年
- 美国白蛾是一种重要的外来入侵性害虫，其围食膜是害虫生物防治的潜在靶标。本研究以美国白蛾中肠为材料，通过提取其总RNA、分离纯化mRNA、反转录合成cDNA等方法，构建了美国白蛾中肠cDNA表达文库。测得文库的原始滴度为4．08×10^5pfu／mL，蓝白斑鉴定该文库的重组率为95．7％，插入片段大小在0．8~2．3kb之间，平均长度为1．77kb。将所得到原始文库扩增后进行保存，检测扩增文库滴度为3．92×10^8pfu／mL。美国白蛾中肠cDNA表达文库的成功构建为克隆美国白蛾围食膜蛋白基因，开发环保型微生物杀虫剂提供可靠的理论依据。
- 刘海明宋雯雯谭秀梅郑桂玲李长友周洪旭
- 关键词：美国白蛾围食膜CDNA文库基因克隆
- 华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠羧酸酯酶基因HoCL1的克隆与序列分析被引量：3
- 2012年
- 利用粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)围食膜蛋白多克隆抗体,从已构建的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库中筛选得到1个编码羧酸酯酶的cDNA克隆HoCL1,其开放阅读框(ORF)长1 599 bp,编码532个氨基酸,推导的蛋白质分子质量为59.5 kDa,等电点(pI)为4.5。HoCL1蛋白具有羧酸酯酶的保守结构域:1个二硫键形成的位点和1个丝氨酸活性中心,三联体催化活性中心位于Ser207、Asp333和His422上,不含有氮联糖基化位点和氧联糖基化位点,只含有3个半胱氨酸残基。依据氨基酸序列同源性分析和保守结构域分析,HoCL1属于B类酯酶,与赤拟谷盗Tribolium castaneum羧酸酯酶相似性最高,为35.2%。通过与其他昆虫羧酸酯酶序列比对及构建系统发育树,发现HoCL1羧基端的氨基酸序列保守性低,但靠近N端的活性中心处的氨基酸序列则高度保守,可与赤拟谷盗、异色瓢虫Harmonia axyridis羧酸酯酶聚类在一起。羧酸酯酶HoCL1基因的克隆鉴定为进一步研究该基因在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能奠定了基础。
- 高勇周洪旭郑桂玲李长友
- 关键词：华北大黑鳃金龟羧酸酯酶基因克隆CDNA表达文库
- 美国白蛾围食膜结构的初步研究被引量：5
- 2012年
- 美国白蛾是一种严重危害园林树木的检疫害虫,而围食膜是害虫生物防治的潜在靶标。应用生化技术,初步分析了美国白蛾围食膜蛋白种类、蛋白和糖的含量,测定荧光增白剂FB28对围食膜的影响。结果表明:美国白蛾围食膜富有弹性,韧性强,很容易得到完整的围食膜,主要有蛋白质、糖类和几丁质组成,其蛋白质含量为32.26%,糖类含量为7.71%。经SDS-PAGE测定,美国白蛾围食膜有14条蛋白带,分子量在7～220 ku之间。研究发现,荧光增白剂FB28能够破坏美国白蛾围食膜,而2%FB28离体处理围食膜12 h,降解的蛋白质最多,为应用FB28与微生物杀虫剂联合防治美国白蛾提供了理论依据。
- 刘海明李长友周洪旭
- 关键词：美国白蛾围食膜
- 荧光增白剂对鳃金龟围食膜的影响及其对B.t.的增效作用
- 2011年
- [目的]B.t.防治鳃金龟幼虫存在杀虫效果慢、幼虫死亡率低的缺点,试验目的是提高B.t.对鳃金龟幼虫的杀虫活性。[方法]应用荧光增白剂FB28处理华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜,并通过FB28与B.t.对暗黑鳃金龟进行生物测定。[结果]荧光增白剂FB28能解离华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜,分别至少有11条和8条蛋白多肽被解离,且随处理时间的增长,蛋白被解离的量增大,围食膜被破坏程度增大。FB28与B.t.一起使用,对其具有明显的增效作用。[结论]围食膜蛋白主要是几丁质结合蛋白,FB28可使几丁质结合蛋白从围食膜上解离下来,FB28对B.t.杀虫具有增效作用,为应用荧光增白剂作为增效因子防治鳃金龟幼虫提供了理论依据。
- 周洪旭郑桂玲李长友
- 关键词：围食膜华北大黑鳃金龟暗黑鳃金龟荧光增白剂
