上海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划(10XD1406500)
- 作品数：1 被引量：4H指数：1
- 相关作者：左明辉叶真龙金华君钱其军黎江更多>>
- 相关机构：第二军医大学浙江理工大学更多>>
- 发文基金：上海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 多靶向VEGF-EGFR的Fc融合蛋白EVP1的构建及其结合特性被引量：4
- 2012年
- 目的:构建能同时靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的Fc融合蛋白EVP1,并分析其多靶向结合功能,为后续的抗肿瘤研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增Herin基因和Flt-1基因Ig样第二结构域(Flt-1D2)编码序列,全序列合成带有点突变的人IgG1的Fc段编码序列,利用重组PCR方法将Herin、Flt-1D2和Fc基因依次连接,构成Herin-Flt-1D2-Fc基因(命名为EVP1基因)。再将EVP1编码基因插入质粒pDC659,构建携带EVP1基因的腺病毒穿梭质粒pDC659-EVP1。将质粒pDC659-EVP1与腺病毒骨架载体pPE3-F35共转染至293细胞,包装获得表达EVP1融合蛋白的非增殖型腺病毒Ad5/35-EVP1,经PCR鉴定,扩增、纯化病毒,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用MOI=11的腺病毒Ad5/35-EVP1感染293细胞,4 d后收集细胞培养上清液。采用硫酸铵盐析法和Protein G亲和层析对融合蛋白EVP1进行纯化。Western blotting检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的含量。采用间接免疫荧光实验和Octet Red 96生物分子相互作用分析仪对融合蛋白EVP1的靶向结合特性进行定性和定量检测。结果:成功包装出腺病毒Ad5/35-EVP1,滴度为5.4×109PFU/ml。腺病毒Ad5/35-EVP1-293细胞系统能有效表达融合蛋白EVP1;MOI=11时,融合蛋白EVP1的表达量为(1 613.94±24.65)ng/ml。蛋白EVP1与高表达EGFR的A431细胞和高表达HER2的人卵巢癌SK-OV-3细胞有良好的结合能力,与抗原EGFR、HER2、VEGF结合的亲和力常数Kd分别为4.55、18.70和0.63 nmol/L。结论:成功制备多靶向融合蛋白EVP1,它能高效结合VEGF、EGFR受体家族成员,具有良好的抗肿瘤临床应用价值。
- 左明辉金华君黎江易中梅叶真龙钱其军
- 关键词：靶向治疗融合蛋白表皮生长因子受体FC段
