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国家自然科学基金(30300186): 作品数：13 被引量：94H指数：4; 相关作者：韩忠朝刘拥军韩之波卢士红王彤更多>>; 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院福建医科大学中国医学科学院中国协和医科大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

人促血液血管细胞生成素的高效表达和快速纯化: 2005年; 目的构建人促血液血管细胞生成素(HAPO)的表达载体,获得纯化的HAPO蛋白并研究其生物学功能。方法通过PCR方法扩增人HAPO基因,克隆于不同的原核表达载体,ITPG诱导融合蛋白表达。NTA层析柱纯化融合蛋白,再经肠激酶裂解融合蛋白,阳离子交换层析纯化,得到纯化的重组蛋白。用培养的MO7e和ECV-304细胞检测蛋白活性。结果HAPO可在pET32C中,获得稳定高效的可溶性表达。在E coli BL21(DE3)中,HAPO表达量可占菌体总蛋白的10%左右。重组蛋白80%是以可溶性蛋白形式存在。NTA层析柱纯化得到的HAPO融合蛋白,再经肠激酶裂解,阳离子交换层析纯化,得到90%以上纯度的重组HAPO蛋白,并且具有良好的生物学活性。结论得到具有90%以上纯度的重组HAPO蛋白,而且,对MO7e和ECV-304细胞具有促增殖的作用。我们获得了纯化的人重组HAPO蛋白,为进一步研究其功能及临床应用打下基础。; 任倩刘拥军徐斌韩之波卢士红马凤霞韩忠朝; 关键词：融合蛋白纯化层析纯化细胞生成素 ECV-304细胞

儿童急性淋巴细胞白血病ERCC1基因多态性分析被引量：4: 2007年; 目的：探讨剪切修复基因ERCC 18092C〉A和19007G〉A遗传多态性与儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的相关性。方法：采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法,分析183例儿童ALL患者（病例组）和190例健康对照者（对照组）的ERCC1基因型。结果：病例组与对照组中2个基因位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律;病例组ERCC1基因C8092A位点的基因型频数分布：AA为15（8.2%）,AC为57（31.1%）,CC为111（60.7%）;对照组该位点基因型频数分布：AA为13（6.8%）,AC为83（43.7%）,CC为94（49.5%）,两组间基因型频数分布差异有显著性（P〈0.05）;CC基因型频数病例组高于对照组（P〈0.05）,其OR为1.57（95%CI为1.04-2.37）;按性别分层,ERCC1G19007和C8092A男性病例组与男性对照组的基因型频数分布差异均有显著性（P〈0.05）;按年龄分层,ERCC1C8092A小于10岁病例组与对照组CC基因型分布频数差异有显著性（P〈0.05）。结论：ERCC 18092CC基因多态性与中国儿童ALL的发生发展有关联性。; 王思力李悦玮许现辉张静张翔宇韩明哲韩忠朝; 关键词：ERCC1 白血病聚合酶链反应儿童

小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性和体外诱导分化被引量：7: 2005年; 目的研究小鼠骨髓间充质干细胞的生物学性状和多系分化潜能。方法取Balb/c小鼠骨髓单个核细胞在低糖的培养液中培养出贴壁生长的细胞,进行形态学观察、细胞周期和免疫表型分析;在不同的因子作用下诱导向成骨细胞、软骨细胞,脂肪细胞分化,并检测诱导后细胞相应的基因表达。结果小鼠骨髓间充质干细胞贴壁生长后形态较均一,增殖能力随着传代逐渐增强,但从第8代后增殖能力明显减退。细胞表达CD2 9,CD38,CD4 4 ,CD10 6等标记,但CD34和H -2k表达阴性。在不同的诱导培养体系里间充质干细胞能分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,相应的骨钙蛋白基因,Ⅱ型胶原基因,脂蛋白脂酶基因表达都明显增强。结论从小鼠骨髓可以分离培养出间充质干细胞,在体外有效扩增和诱导分化。表明可以以小鼠为模型研究间充质干细胞在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的运用。; 许贞书刘拥军吕璐璐韩之波王彤陈志哲韩忠朝; 关键词：小鼠骨髓间充质干细胞软骨细胞增殖能力原基脂肪细胞分化

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状被引量：44: 2006年; 目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。; 吕璐璐刘拥军许贞书王彤张浪辉朱雄鹏梁琳慧王晗陈志哲韩忠朝; 关键词：间充质干细胞脐带多能干细胞

基质细胞抑制HL-60细胞凋亡机制初探被引量：2: 2005年; 许贞书刘拥军吕璐璐韩之波王彤陈志哲韩忠朝; 关键词：基质细胞 HL-60 细胞凋亡髓系白血病细胞

蛋白质相互作用的研究方法被引量：5: 2005年; 蛋白质相互作用的研究是现代分子生物学研究领域一个很重要的方面。该文介绍了经典的和最近新建立的研究蛋白质相互作用的方法,并比较了各种方法的优缺点和所适用的领域。; 梁琳慧韩忠朝; 关键词：蛋白质相互作用信号转导

人促血液血管生成素的原核表达、分离纯化及活性分析被引量：1: 2005年; 目的利用基因工程技术获得重组的人促血液血管生成素(HAPO),以探讨其对骨髓细胞的作用。方法提取人胎肝总RNA,利用RT-PCR、克隆HAPO cDNA插入表达载体pET32c,使之在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;用DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱、Ni-Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱以及SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱分离纯化,肠激酶酶切,液体培养小鼠骨髓细胞。结果经IPTG诱导HAPO实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,经一系列层析获得融合的rh-HAPO,肠激酶酶切除去N-端融合部分后,获得高纯度的rh-HAPO。液体培养小鼠骨髓实验发现rh-HAPO可促进CD34+细胞和flk-1细胞的增殖。结论重组蛋白rh-HAPO可促进造血干/祖细胞的增殖。; 刘拥军任倩韩之波杨萍王彤卢士红韩忠朝; 关键词：基因表达分离纯化大肠杆菌

缺氧诱导因子-1与细胞凋亡被引量：23: 2005年; 缺氧诱导因子 1(HIF -1)是一种主要由缺氧诱导细胞产生的重要的转录因子。HIF- 1的表达水平与糖酵解、细胞周期阻滞、细胞生存与增殖、血管新生、血管舒缩、红细胞生成、肿瘤生长,转移以及肿瘤多药耐药等许多生命活动密切相关。HIF- 1通过调控凋亡相关基因的转录在促细胞凋亡和抗细胞凋亡中都发挥着重要的作用。; 王晗韩忠朝; 关键词：缺氧诱导因子-1 细胞凋亡抗细胞凋亡

人促血液血管细胞生成素的原核表达及兔抗体的制备被引量：2: 2006年; 目的:表达人促血液血管细胞生成素(hemangiopoi-etin,HAPO)蛋白并制备兔抗HAPO抗体。方法:利用硫氧还原蛋白TrxA融合表达载体(pET32c),表达可溶性HAPO。表达的HAPO融合蛋白经亲和层析快速纯化,并通过Westernblot进行鉴定。以纯化的人HAPO免疫新西兰大白兔,制备抗体并测定其效价。结果:获得高效表达并纯化的HAPO蛋白。制备的兔抗人HAPO抗体的免疫双扩散的效价为1∶8。结论:建立了HAPO基因的原核表达载体和快速纯化体系并制备出兔抗HAPO的抗体,为研制检测HAPO的ELISA试剂盒奠定了基础。; 任倩刘拥军徐斌韩之波卢士红马凤霞陈钟韩忠朝; 关键词：抗体制备

血液血管细胞生成素对胎儿骨髓造血和内皮干细胞作用的研究被引量：1: 2005年; 目的研究人血液血管细胞生成素(hemangiopoietin,HAPO)对胎儿骨髓细胞的作用,探讨其生物学特性。方法采用细胞液体培养、半固体培养、MTT方法、免疫荧光标记流式细胞仪测定、免疫组化、显微镜观察照相等方法。结果在液体培养3周的胎儿骨髓单个核细胞中,HAPO组中出现了大量小而圆的早期造血细胞,其中CD34+细胞含量比对照组高20%,对照组CD34+细胞为1.25×105个,而HAPO组CD34+细胞为3.93×106个。取胎儿骨髓悬浮造血细胞进行半固体培养,对照组不能形成CFU-GEMM,而HAPO组形成CFU-GEMM数达到(11.0±2.6)个;HAPO也协同SCF、IL-3、GM-SCF等生长因子促进集落形成,CFU总数是对照组2.6倍,CFU-GEMM数HAPO组是对照组2.1倍。MTT方法发现,HAPO对胎儿骨髓基质细胞也有促增殖作用,HAPO可使基质细胞增长21%;液体培养的胎儿骨髓基质细胞中,有内皮特异性标志的细胞均增高;在甲基纤维素半固体培养中HAPO使胎儿骨髓内皮细胞的集落数增高,并出现条索状排列的集落,有促进血管形成的趋势。进一步证明HAPO可直接促进CD34+KDR+细胞的增殖。结论HAPO对骨髓造血和血管内皮干细胞均有刺激增殖作用。; 卢士红刘拥军闫凤英杨仁池任倩杨晨张磊任贺韩忠朝; 关键词：造血干细胞血液血管干细胞

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