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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2表达分析被引量：4: 2013年; 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组蛋白纯化后作为免疫抗原,制备Nsp2特异性单克隆抗体。将携带nsp2基因的真核表达载体转染至Marc-145及HEK293细胞,或将PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点收集细胞样品。免疫荧光观察Nsp2在转染细胞中的亚细胞定位,免疫印迹分析Nsp2在真核细胞中的表达。筛选获得了1株稳定分泌特异性抗Nsp2的单克隆杂交瘤细胞株,能用于免疫荧光和印迹分析。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2主要定位于细胞质中,免疫印迹检测到约为120与50ku的蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞质。病毒感染8h,可检测到120ku左右的Nsp2蛋白条带,感染后12h可检测到70和50ku左右的Nsp2蛋白,且蛋白表达量随感染时间延长显著增多。PRRSV感染细胞中Nsp2的表达与剪切分析,为深入研究该蛋白在病毒复制和致病中的功能奠定了基础。; 温贵兰张涵淞扈鸿霞章先张毅王晓杜李肖梁方维焕; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的克隆和原核表达被引量：5: 2013年; 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可引起各种年龄猪的呼吸系统和母猪繁殖机能障碍,导致猪场损失严重,其中GP5蛋白在PRRSV病毒侵入、致病及免疫保护中发挥重要作用。提取猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA,反转录合成cDNA,PCR扩增获得GP5基因,片段大小为600bp。将GP5基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定,重组质粒PGEX-6P-1-GP5构建成功,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,Western blot分析重组蛋白的反应原性。结果表明,重组融合蛋白His-GP5分子质量约为41ku,主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的35%以上,纯化后的重组蛋白占总蛋白的75%以上;并且该重组蛋白能与猪的阳性血清反应,说明其具有较好的免疫原性。研究结果为基因工程疫苗的研发和GP5的抗体制备奠定了基础。; 袁庄川王鲁彦梅匀安张敏王晓杜; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因原核表达纯化

猪 Siglec-10基因的克隆与生物信息学分析: 2014年; 为了研究猪Siglec-10(pSiglec-10)的分子生物学特征,利用Ensemble网站提供的预测序列(ENSSSCT00000032460)设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,克隆pSiglec-10分子的全长CDS区,经过测序比较鉴定正确后,对该分子的基本特征进行分析;构建截短pSiglec-10的原核表达载体,另将该分子的CDS区全长克隆至真核表达载体pcDNA3.1-3′FLAG,将重组质粒转染至PK-15和Marc-145细胞中分析其表达定位特征。结果克隆的pSiglec-10分子的全长CDS为2 127bp,编码709个氨基酸;pSiglec-10基因序列与猴的同源性最高,同源性达73.6%,与鼠的同源性为66.9%;与人的同源性为62.5%,氨基酸序列的同源性分别为58.9%、69.4%和65.3%;pSiglec-10C端的ITIM区域和磷酸化位点高度保守;pSiglec-10分子具有较好的抗原特性和亲水性;该分子主要表达定位在细胞浆中,在Marc-145细胞中呈不连续的点状分布于细胞浆,细胞核周围荧光强度较强。pSiglec-10分子全长CDS区的克隆和分析将对该分子的功能研究提供一定的理论依据。; 张毅张晏王晓杜方维焕温贵兰; 关键词：分子克隆真核表达生物信息学分析

荧光定量RT-PCR检测PRRSV方法的建立及初步应用被引量：4: 2016年; 以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5保守区域为靶基因,基于SYBR Green构建了以RNA为模板、反转录和PCR扩增一步完成的荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法对质粒和细胞培养物中病毒的检测限分别为1×100copies/μL和1×10-2TCID50/m L;组内和组间差异系数(CV)均小于5%。利用本方法检测126份临床组织样品,PRRSV阳性率为42.06%,与传统RT-PCR检测结果具有较好的一致性(Kappa=0.918),且敏感性显著高于传统RT-PCR。本研究建立的qRT-PCR方法为猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断提供了技术手段。; 周一媚劳秀杰黄巧莲徐露凝郑悦叶笑王晓杜邵春艳杨永春宋厚辉; 关键词：ORF5

猪繁殖与呼吸综合征的抗病育种研究进展被引量：1: 2014年; 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是近期危害养猪业最重要的疾病之一。培育抗病性品种是该病综合防治的一个有效方法。文章围绕该病抗病育种候选基因研究的主要进展进行综述,内容涉及病毒特异性受体基因、先天性免疫相关基因、抗原递呈信号通路相关基因、胞内miRNA等,并重点就今后PRRSV疾病耐受性和提高适应性免疫应答能力的研究进行展望。; 王晓杜镡忠斌王鲁彦何珂李开桢潘清煜周圻; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征抗病育种候选基因

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中国博士后科学基金(2012M521187)

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