国家自然科学基金(3117062)
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- 泡桐丛枝植原体pPaWBNy-1-ORF5编码蛋白的原核表达和抗体制备
- 2013年
- 利用含泡桐丛枝植原体质粒pPaWBNy-1的3.0 kb片段的克隆为模板,PCR扩增pPaWBNy-1-ORF5的亲水性肽段编码区。目的片段连接到原核表达载体pET28a(+),重组质粒pET28a-ORF5-5转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosseta(DE3)感受态细胞,菌液处在对数生长期时(OD600=0.52),添加IPTG诱导5 h后收集菌体,提取蛋白并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用六聚组氨酸标签抗体进行Western blot检测,发现分子量约为15 kDa的含多聚组氨酸标签的目的蛋白得到表达。切胶回收融合蛋白,免疫德国大白兔以制备抗血清,间接ELISA法测定抗血清的效价约为1∶8 100。用制备的ORF5编码蛋白的抗血清进行Western blot分析,结果在带菌的介体昆虫茶翅蝽(Halyomorpha halys)中检测到大小约为17 kDa的特异蛋白条带,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp.)及无菌茶翅蝽中均未检测到,由此推测pPaWBNy-1-ORF5蛋白与介体昆虫传播植原体有关。
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- 关键词：泡桐丛枝病植原体茶翅蝽原核表达
- 泡桐丛枝植原体pPaWBNy-2-ORF4编码蛋白的抗体制备和表达分析
- 2013年
- 以感病泡桐组培苗提取的DNA为模板,采用PCR方法扩增pPaWBNy-2-ORF4的部分片段。将目的片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,重组质粒pGEX-p2ORF4转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株。IPTG诱导表达,分子量约为38 kDa的含GST标签的融合蛋白得到表达。切胶回收目的蛋白,免疫大白兔制备抗血清。间接ELISA测定抗血清的效价约为1∶4 096,免疫印迹实验显示:抗血清能够与原核表达的GST融合蛋白发生特异的免疫反应,与pPaWBNy-1-ORF5的原核表达蛋白无明显的交叉反应。利用制备的抗血清,在感病泡桐饲毒的茶翅蝽中检测到分子量约为18 kDa的蛋白条带,而在无菌茶翅蝽和感病泡桐组培苗中均未检测到,表明pPaWBNy-2-ORF4在饲毒的茶翅蝽中表达,而在感病泡桐组培苗中未表达或表达量低于检测水平。据此推测,该基因参与茶翅蝽传播泡桐丛枝植原体。
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- 关键词：茶翅蝽多克隆抗体植原体
