国家自然科学基金(30571830)
- 作品数：13 被引量：15H指数：2
- 相关作者：陈坚方国恩钱其军苏长青刘绪舜更多>>
- 相关机构：第二军医大学解放军第81医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 可调控腺病毒载体Ad-RUDsRed构建及其在结肠癌SW620细胞中表达的实验研究
- 2010年
- 目的:构建带有RU486可调控红色荧光蛋白(DsRed)的复制缺陷型腺病毒Ad-RUDsRed,用于肿瘤基因治疗。方法:构建带有RU486调控系统和DsRed基因的腺病毒穿梭质粒pDC-RUDsRed,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定。利用AdMaxTM系统重组得到腺病毒Ad-RUDsRed,进行扩增、纯化和滴度测定;腺病毒Ad-RUDsRed感染SW620细胞细胞株后分别加入0、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7和1×10-6mol/L的RU486诱导,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad-RUDsRed调控功能。结果:PCR结果证实,成功构建可调控腺病毒载体Ad-RUDsRed,病毒滴度3.46×1010pfu/mL。DsRed的表达与RU486剂量相关,无RU486时,报告基因DsRed几乎没有表达。给予诱导剂RU486,腺病毒载体可以诱导表达红色荧光蛋白,RU486剂量达1×10-6mol/L时DsRed的表达量达到最大值。结论:成功构建携带RU486可调控DsRed的复制缺陷型腺病毒Ad-RUDsRed,通过RU486可以诱导调控DsRed的表达,为肿瘤的基因治疗奠定了基础。
- 陈坚刘绪舜王峰宗光全薛绪潮方国恩
- 关键词：腺病毒科基因表达调控
- 基因诱导调控系统研究进展
- 2007年
- 陈坚薛绪潮
- 关键词：基因治疗基因调控四环素蜕皮激素RU486
- 可调控的鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体外表达
- 2008年
- 目的构建可经米非司酮(RU486)调控表达小鼠白细胞介素-12(mIL-12)单链融合基因的真核载体,并鉴定其调控表达效果。方法以GCp35Ep40PN质粒为模板,分别获取mIL-12p40和p35亚基的基因,重叠PCR引入linker后,克隆入pCA14质粒,测序正确之后,装入可调控载体pRS-17而构建成真核表达质粒pRS-RUmIL-12。用Lipofectamine2000将pRS-RUmIL-12质粒转染HEK293细胞,以不同剂量的RU486诱导其表达,然后用ELISA法检测其培养上清液中mIL-12蛋白的含量。结果所得mIL-12单链融合基因序列与设计一致。pRS-RUmIL-12在体外转染HEK293细胞后,ELISA检测结果表明该系统具有良好的调控能力:无诱导剂RU486时,mIL-12蛋白表达量很低,而加入诱导剂RU486后,可以诱导mIL-12的表达,并在一定范围内mIL-12的蛋白表达量与诱导剂的浓度呈正相关。结论成功构建了可经RU486调控的mIL-12双亚基共表达的真核表达质粒,可用于进一步的基因调控和基因治疗研究。
- 陈坚张斌薛绪潮方国恩苏长青钱其军
- 关键词：白细胞介素-12融合基因真核表达米非司酮
- 可诱导表达mIL-12单链融合蛋白的腺病毒载体的构建
- 2008年
- 目的:构建带mIL-12单链融合蛋白基因并可经RU486诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于体内的基因治疗研究。方法:构建穿梭质粒pDC-RUmIL-12,使mIL-12单链融合蛋白基因和启动子在RU486诱导表达系统调控之下,酶切、测序鉴定正确后,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染HEK293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,用mIL-12引物对病毒进行鉴定。氯化铯密度梯度离心纯化病毒,最终稀释法测定其滴度,并在结肠癌SW620细胞中Western Blot和ELISA法检测其基因调控效果。结果:经PCR鉴定证实可调控腺病毒载体Ad-RUmIL-12构建正确,病毒滴度达到4.62×1010pfu/mL。当给予诱导剂RU486后,腺病毒载体可以诱导表达mIL-12单链融合蛋白,表达量随着诱导剂浓度而增加,而没有RU486时,几乎没有mIL-12蛋白的表达。结论:成功构建了重组腺病毒Ad-RUmIL-12,可以通过RU486诱导mIL-12单链融合蛋白的表达,为下一步体内基因治疗奠定了良好的基础。
- 陈坚薛绪潮方国恩苏长青钱其军
- 关键词：白细胞介素12腺病毒科基因调控RU486
- 腺病毒载体介导的可调控鼠白细胞介素12基因对大肠癌小鼠的治疗效果被引量：1
- 2009年
- 目的构建携带鼠白细胞介素12（mIL-12）基因并可经RU486诱导表达的重组腺病毒载体，研究其对小鼠大肠癌移植瘤的治疗效果及安全性。方法将穿梭质粒pDC-RUmIL-12与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒pBHGIoxΔE1，3Cre共转染HEK293细胞后，构建出可调控的复制缺陷性重组腺病毒载体，用mIL-12引物对病毒进行鉴定；氯化铯密度梯度离心纯化病毒，最终稀释法测定其滴度。体外感染结肠癌C26细胞后，用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测其基因调控表达。皮下注射C26大肠癌细胞构建小鼠大肠癌动物模型，将60只小鼠分成4组（Ad-缓冲液对照组、Ad-RUmIL-12对照组、Ad-RUmlL-12＋RU486治疗组和Ad-mIL-12治疗组），从各组的肿瘤大小、病理及血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平等方面评价各组的治疗效果及不良反应。结果经PCR鉴定证实可调控腺病毒载体Ad-RUmIL-12构建正确，纯化后病毒滴度达到4．62×10^10空斑形成单位（pfu）／ml。病毒感染体外培养的C26细胞后，给予诱导剂RU486则最高可诱导表达mIL-12蛋白（516±43）pg／ml，而不加入和去除RU486时，只有少量的raiL-12蛋白表达[（38±3）pg／ml、（42±5）pg／mJ]。在小鼠动物模型上，Ad-RUmIL-12对照组和Ad-缓冲液组肿瘤生长较快；Ad-RUmIL-12＋RU486治疗组和Ad-mIL-12治疗组对肿瘤生长有明显的抑制作用，病理检查显示两组肿瘤有较明显的坏死，而前组小鼠的血清ALT水平和不良反应发生率明显低于后组（4／15比10／15，P〈0．05）。结论成功构建了可调控重组腺病毒Ad-RUmIL-12，可以通过RU486诱导mIL-12蛋白的表达，并对大肠癌移植瘤有杀伤作用，明显提高了肿瘤基因治疗的安全性。
- 陈坚刘绪舜王峰薛绪潮方国恩苏长青钱其军
- 关键词：基因调控网络白细胞介素12结肠肿瘤小鼠腺病毒载体
- 第三代腺病毒载体的改良与应用被引量：6
- 2007年
- 腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗。第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体与前者相比,具有低免疫原性及高容量等优点,在基因治疗中表现出独特优势。然而,由于辅助病毒污染的存在及病毒产量有待提高,第三代腺病毒载体的临床应用仍面临一定困难。
- 陈琳薛绪潮
- 关键词：辅助病毒
- RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达被引量：3
- 2008年
- 目的构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用。方法利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可调控载体pRS17-RUDsRed。在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达。结果PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性。没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达。结论成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的基因表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础。
- 陈坚薛绪潮方国恩苏长青钱其军
- 关键词：RU486基因调控红色荧光蛋白
- 携带红色荧光蛋白的RU486可诱导真核表达载体的构建及其表达被引量：2
- 2008年
- 在基因治疗中,实现目的基因的调控表达是非常重要的。然而,传统基因载体的无调控地持续或不适当的表达会影响治疗效果,甚至可能带来致命的副作用。在本研究中,我们构建了一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外评估了其调控表达作用。利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成单一的质粒载体PDC-RURED,为减少RU486调控元件和基因表达元件之间的相互干扰,在两者之间加入1.6kb的绝缘子。经PCR检测和限制性酶切分析及序列测定均证实了载体的正确性。在转染HEK293细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术证实了该载体的调控能力。没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,而加入诱导剂RU486后,最高可以实现红色荧光蛋白的40余倍的表达。实验结果表明构建的可经RU486诱导的新型真核表达载体可以实现对目的基因的表达时间和表达水平的调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗提供了良好的工具。
- 陈坚薛绪潮方国恩苏长青钱其军
- 关键词：RU486基因调控红色荧光蛋白
- 米非司酮调控的单链鼠白介素12真核表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2008年
- 构建含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核载体,在体外鉴定其调控表达效果。用PCR技术从GCp35Ep40PN质粒上获取白细胞介素12的p40和p35亚基的基因,通过2次PCR技术引入linker后得到单链白细胞介素12基因,将其与米非司酮诱导调控系统克隆入pDC312质粒,构建成真核表达载体pDC-RUmIL-12,通过限制性内切酶和PCR鉴定其正确性。在体外用脂质体转染法将pDC-RUmIL-12载体转染HEK293细胞株,以不同的剂量米非司酮诱导载体表达,然后用ELISA法检测培养液上清中mIL-12蛋白的含量。测序结果表明所得鼠白细胞介素-12融合单链基因序列与设计相一致。酶切分析和PCR证实载体pDC-RUmIL-12构建正确。将pDC-RUmIL-12转染HEK293细胞并经米非司酮诱导表达后,ELISA检测结果表明该载体有良好的调控能力。没有诱导剂米非司酮时,只有极少量的mIL-12蛋白表达,而加入诱导剂米非司酮后,mIL-12表达量明显增加,并在一定范围内与米非司酮剂量呈正比。成功构建了含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核载体,可用于肿瘤的基因治疗研究。
- 陈坚薛绪潮方国恩苏长青钱其军
- 关键词：白细胞介素-12米非司酮融合基因
- 米非司酮基因诱导调控系统被引量：2
- 2008年
- 在基因表达和基因治疗研究中,需要目的基因在特定的时间以适当的水平实现其表达,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,在疾病治疗中甚至会产生致命的副作用,实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控是一个非常关键的问题。目前生物学家们已构建了多种新型的基因表达调控系统,其中米非司酮诱导调控系统具有诱导效率高,背景表达低,安全性高等诸多优点,是基因调控研究中的重要进展,也是目前最有应用前景的调控系统之一。就其结构设计和应用研究方面的进展作一简要综述。
- 陈坚薛绪潮
- 关键词：米非司酮
