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重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用被引量：3: 2010年; 目的观察重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子（rAAV2-PEDF）对氧诱导小鼠视网膜新生血管（RNV）的作用.方法选择3日龄C57/BL6小鼠22只,左眼为实验服,右眼为对照眼,微量注射器玻璃体腔分别注射rAAV2-PEDF和rAAV2-绿色荧光蛋白1μl.注射后立即将小鼠放入氧箱,建立氧诱导血管增生性视网膜病变模型.取13日龄小鼠4只提取视网膜总蛋白,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表达.17日龄小鼠12只,荧光素心脏灌注视网膜铺片观察血管形态和分布.17日龄小鼠6只,视网膜冰冻切片外源凝集素标记后染色观察血管形态和分布.Image-Pro Plus5.1软件测量分析无荧光素灌注区和RNV的绝对面积和相对面积.结果实验眼PEDF蛋白表达显著高于对照眼.视网膜铺片定量结果显示,实验眼和对照跟绝对无灌注区面积分别为（0.96±0.22）、（1.96±0.34）mm^2,差异有统计学意义（t=-8.554,P〈0.01）;相对无灌注区面积分别为（8.64±1.52）%、（17.27±2.98）%,差异有统计学意义（t=-8.97,P〈0.01）.实验眼和对照眼绝对新生血管面积分别为（0.37±0.11）、（1.26±0.38）mm^2,差异有统计学意义（t=-7.8,P〈0.01）;相对新生血管面积分别为（3.96±0.66）%、（11.45±2.06）%,差异有统计学意义（t=-8.51,P〈0.01）.外源凝集素标记定量结果显示,实验眼和对照眼RNV面积分别为（0.11±0.003）、（0.41 4-0.02）mm^2,差异有统计学意义（t=-5.14,P〈0.01）.结论 rAAV2-PEDF可成功转染小鼠视网膜组织并稳定表达PEDF蛋白,不仅可以减少氧诱导血管增生性视网膜病变小鼠视网膜无灌注面积,而且可显著抑制RNV生成.; 李涛丁小燕马红婕梁小玲罗燕唐仕波; 关键词：细胞因子类基因转移技术

核运输因子2在糖尿病大鼠视网膜的时空表达及其意义被引量：2: 2010年; 目的:探讨糖尿病大鼠视网膜中核运输因子2(NTF2)的时空表达变化及意义。方法:伊凡思蓝(EB)灌注铺片观察糖尿病大鼠视网膜血管分布和形态。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测与糖尿病大鼠不同时点鼠龄匹配的对照组(N2w,N1m,N3m,N6m)和糖尿病成模后2周、1月、3月、6月(D2w,D1m,D3m,D6m)大鼠视网膜中NTF2、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达。免疫组化法检测NTF2蛋白在视网膜中的表达和分布位置。结果:正常组大鼠可见在低背景荧光下视网膜血管对EB有很好的屏障作用,成模1月后糖尿病大鼠视网膜血管仅见背景荧光增强,成模3月后血管出现异常节段性扩张,局部血管周围EB渗漏。与糖尿病大鼠年龄匹配的正常大鼠视网膜NTF2和VEGF并未随时间延长而变化,mRNA表达稳定。糖尿病成模2周后开始,NTF2mRNA有轻度增高,并随病程的延长保持较高水平,病程达6个月时,NTF2表达开始回落,与正常大鼠基本一致。NTF2蛋白在正常大鼠及糖尿病大鼠视网膜中免疫组化均可以检出,主要分布在视网膜内层,以节细胞层、内核层为主。结论:NTF2mRNA水平在糖尿病大鼠视网膜中升高,主要分布在视网膜内层。NTF2很可能在糖尿病视网膜病变中起着一定的调控作用,其作用途径及机制可能与VEGF的作用通路有一定的联系。; 史煜陈春生曹亮陈凌燕谢琳唐仕波; 关键词：血管内皮生长因子糖尿病视网膜病变

重组AAV2-NTF2对人视网膜微血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响: 2010年; 目的观察核运输因子2(NTF2)在体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(RCECs)中的表达,并探讨其高表达对RCECs中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法取中山眼科中心眼库的人眼球,分离视网膜组织用以培养人RCECs,并用Ⅷ因子抗体免疫组织化学法鉴定。免疫组织化学法观察细胞中NTF2的表达。通过重组腺相关病毒(rAAV2)将外源性NTF2导入培养的RCECs内,rAAV2-NTF2和rAAV2-EGFP转染RCECs,未转染组为对照组。激光共焦显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组NTF2、VEGFmRNA的表达变化,并进行定量分析。结果培养的RCECs呈典型铺路石样排列,荧光显微镜下可见Ⅷ因子阳性表达为绿色荧光,95%以上的活体细胞可摄取DiI标记的Ac-LDL,并在荧光显微镜下呈现红色荧光。RCECs可表达NTF2,主要位于细胞质内,富集于核周。rAAV2-EGFP转染后,激光共焦显微镜观察可见大量EGFP阳性细胞,实验组NTF2在mRNA水平表达明显强于GFP组和对照组(t=15.06,t=7.02,P<0.01),VEGF表达明显下降(t=7.40,t=14.08,P<0.01)。结论 rAAV2-NTF2转染视网膜内皮细胞后,NTF2可稳定高表达,VEGF表达下降,NTF2可能通过调节VEGF的表达参与新生血管的发生。; 史煜陈春生曹亮陈凌燕谢琳唐仕波; 关键词：血管内皮生长因子

rAAV2-NTF2对糖尿病大鼠血视网膜屏障的保护作用被引量：5: 2009年; 目的:观察2型重组腺相关病毒-核运输因子2(rAAV2-NTF2)对糖尿病大鼠血视网膜屏障功能损伤的拮抗作用。方法:伊凡思蓝(EB)灌注铺片观察糖尿病大鼠视网膜血管分布和形态。亚克隆构建pSNAV-NTF2载体,腺相关病毒包装形成rAAV2-NTF2。成年雄性Wistar大鼠,以右眼为实验眼,玻璃体腔注射4μLrAAV2-NTF2,左眼为对照眼,玻璃体腔注射rAAV2-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)4μL。1个月后取4只大鼠左眼,固定后取视网膜制备全视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达情况。再行STZ腹腔注射诱导糖尿病,同时设单纯糖尿病组(diabetes,D组)和正常组(normal,N组)。糖尿病1个月后以45 mg/kg剂量静脉注射EB,循环2 h后1%多聚甲醛枸橼酸缓冲液灌注并摘除眼球取视网膜,置于甲酰胺中浸泡提取染料,用分光光度计测量甲酰胺中染料的浓度。结果:正常组大鼠可见在低背景荧光下视网膜血管对EB有很好的屏障作用,糖尿病2周大鼠视网膜血管仅见背景荧光增强,糖尿病1月后血管出现异常节段性扩张,局部血管周围EB渗漏。糖尿病1个月大鼠视网膜内EB浓度是正常组的4.67倍,P<0.01,提示糖尿病大鼠血-视网膜屏障受损。玻璃体腔注射rAAV2-NTF2,视网膜内EB浓度为(8.30±4.16)μg/g视网膜干重,较对侧眼(22.13±8.43)μg/g视网膜干重明显减少,可以部分改善血-视网膜屏障的破坏,降低EB-白蛋白渗漏(P<0.05)。结论:玻璃体腔注射rAAV2-NTF2可减轻糖尿病大鼠视网膜血-视网膜屏障功能的破坏,为糖尿病视网膜病变的基因治疗提供了实验依据。; 史煜李斌李涛曹亮李永浩马红婕谢琳唐仕波; 关键词：糖尿病视网膜病变腺相关病毒血-视网膜屏障

达氏修正依氏培养基/F12的配制: 2010年; 目的建立达氏修正依氏培养基(DMEM)/F12的配制方法。方法 DMEM/F12配制所需物品均经过严格地消毒灭菌,配液用DMEM/F12粉剂1包+1000mL三蒸水+碳酸氢钠1.2g,在磁力搅拌器搅拌后,利用过滤装置连接真空泵过滤分装培养基;配液后的DMEM/F12液体4℃冰箱保存6个月,加入血清等保存4周。结果配制的DMEM/F12液体无污染,细胞培养效果佳。结论严格执行各种物品清洁消毒和无菌操作而配制的DMEM/F12能有效地用来培养细胞。; 林少芬毛羽翔周焕娇罗燕唐仕波李斌赖平红; 关键词：培养基消毒细胞

体外无血清培养新生SD大鼠视网膜神经细胞被引量：1: 2011年; 目的采用无血清培养建立新生SD大鼠视网膜神经细胞的体外培养方法,为视网膜神经细胞的体外实验研究奠定基础。方法取出生后3～5d的SD大鼠视网膜,用胰蛋白酶消化分离获取细胞悬液,使用无血清神经原培养基(NeurobasalTM-A Medium)和添加剂B-27 Supplement Minus AO进行培养。倒置相差显微镜观察细胞形态及轴突生长情况。培养至第5天,用抗微管相关蛋白2抗体、抗视紫红质蛋白抗体及抗胶质纤维酸性蛋白抗体,行免疫细胞化学鉴定并计算视网膜视杆细胞的纯度。结果采用无血清法培养的视网膜神经细胞生长良好,细胞伸出突起,部分神经元的突起交织呈网状。生长至第5天经免疫细胞化学证实其中神经元细胞占95.6%,而38.6%为视网膜视杆细胞,同时神经胶质细胞的生长得到了很好地抑制。结论无血清培养法可以获取纯度较高的视网膜神经细胞,为研究视网膜光感受器细胞提供了理想的体外实验模型。; 马伟罗燕李涛李士清唐仕波; 关键词：视网膜光感受器细胞体外细胞培养

不同年龄组人视网膜微血管内皮细胞特性的研究(英文): 2009年; 目的:研究2个不同年龄组供体来源的人视网膜微血管内皮细胞的特性。方法:分离培养2个不同年龄组的人视网膜微血管内皮细胞,分别为出生后30 d内和40-65岁供体组。视网膜微血管内皮细胞具有特异性表达,通过免疫荧光染色CD31、vWF和乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)的摄取来定位内皮细胞的标记。通过使用matrigel基质胶培养细胞,激光共聚焦显微镜和Western blotting分析vWF在细胞内的分布,评估2组细胞管状结构形成能力以及vWF在细胞内的不同分布。结果:从2个不同年龄组中成功地获得高纯度视网膜微血管内皮细胞。2组在种到基质胶后6 h均能形成典型的二维管腔样结构,但婴幼儿组评分比成人组高(27.2%±2.2%),且二维管腔样结构在30 h仍可较好地维持,而成人组已看到部分自发降解。另外可见到vWF在婴幼儿组主要表达在细胞核内,而成人组主要表达在胞浆。结论:不同年龄来源的人视网膜血管内皮细胞具有某些自身特定的性状特征,在与年龄相关的疾病的体外研究中,供体年龄因素可能造成的影响应该得到一定的重视。; 李建桥罗燕马伟丁小燕袁玲肖伟李杰史煜唐仕波; 关键词：血管内皮细胞视网膜 WILLEBRAND因子

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国家自然科学基金(30772392)

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