国家自然科学基金(30772320)
- 作品数：4 被引量：8H指数：2
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- 相关机构：北京大学北京市卫生局首都医科大学附属北京妇产医院更多>>
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- 卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究
- 2009年
- 目的探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体/小鼠热休克蛋白70(6B11ScFv/mHSP70)融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其最佳体外复性条件。方法大肠杆菌表达大量融合蛋白6B11ScFv/mHSP70:①比较不同的裂解液(8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍)对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度L-精氨酸对蛋白稀释复性的影响;③比较稀释复性和柱上复性对融合蛋白复性效率及活性的影响。采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度。所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法。结果以包涵体形式表达6B11ScFv/mHSP70蛋白:①经6mol/L盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8mol/L尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6mol/L盐酸胍彻底裂解的包涵体经8mol/L尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0.5mol/LL-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSH)浓度比为1:5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低。结论本研究建立了6B11ScFv/mHSP70融合蛋白的最佳复性条件:包涵体经6mol/L盐酸胍彻底裂解后,再经8mol/L尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0.5mol/LL-精氨酸和GSH:GSSH=1:5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
- 张果昌晓红成夜霞叶雪程洪艳魏丽惠崔恒
- 关键词：卵巢肿瘤重组融合蛋白质类HSP70热休克蛋白质类包涵体
- 卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠HSP70融合蛋白的构建、表达及鉴定被引量：5
- 2008年
- 目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)融合蛋白6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。方法根据Genebank上已发表的mHSP70基因序列(NM_010478)合成引物行PCR扩增,以扩增所得mHSP70基因插入pET30a(+)-6B11ScFv质粒后转化入E.coliDH5α,获得pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70重组质粒。将鉴定正确的pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70重组质粒转化入E.coliBL21(DE3),获得E.coliBL21(DE3)[pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并行SDS-PAGE分析,对表达产物进行复性和Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和ELISA方法进行鉴定和免疫活性检测。结果6B11ScFv/mHSP70融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达20.9%,蛋白纯度达95%以上。蛋白质印迹分析证实6B11ScFv/mHSP70融合蛋白相对分子质量为104000,ELISA检测表明其具有6B11ScFv和mHSP70的免疫活性。结论构建表达的6B11ScFv/mHSP70融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。
- 张果昌晓红石菁菁成夜霞李巍叶雪程洪艳付天云魏丽惠崔恒
- 关键词：HSP70热休克蛋白质类重组融合蛋白质类卵巢肿瘤
- 上皮性卵巢癌免疫治疗的研究进展被引量：2
- 2010年
- 卵巢恶性肿瘤的发病率近40年来增加了2～3倍并有逐步上升的趋势,根据美国癌症协会2007年的报道,22430例新诊断的卵巢癌病例中约有15280例死亡。约90％的卵巢恶性肿瘤为上皮性卵巢癌，其死亡率仍高居妇科恶性肿瘤死亡率之首，并位于妇女死亡原因第五位，严重威胁着妇女的生命和健康。
- 刘婵桢昌晓红崔恒
- 关键词：上皮性卵巢癌免疫治疗卵巢恶性肿瘤肿瘤死亡率发病率妇女
- 6B11ScFv-mHSP70融合蛋白诱导抗卵巢癌免疫应答的体外实验研究被引量：2
- 2008年
- 目的既往研究证实,6B11抗独特型单链抗体(6B11ScFv)具有模拟卵巢癌相关抗原OC166-9的作用。本文研究6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)构建而成的融合蛋白(6B11ScFv-mHSP70)在体外抗卵巢癌免疫应答,探讨其作为卵巢癌疫苗的可能性。方法以大肠杆菌表达6B11ScFv-mHSP70融合蛋白,经变性复性后纯度达95%。采用ELISA检测其免疫学活性。采集HLA-A2阳性的女性健康志愿者的外周血单个核细胞,用6B11ScFv-mHSP70刺激并培养。采用CCK-8法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和对卵巢癌细胞系的细胞毒作用,流式细胞术检测6B11ScFv-mHSP70刺激前后淋巴细胞表型的改变。结果6B11ScFv-mHSP70具有特异性结合卵巢癌单抗COC166-9及抗小鼠-HSP70抗体的双重免疫学活性;可以刺激人外周血淋巴细胞的增殖;并对HLA-A2阳性、OC166-9表达阳性的卵巢癌细胞系有细胞毒作用;经6B11ScFv-mHSP70刺激后,实验组的淋巴细胞表型与未经蛋白刺激的对照组相比:CD4+T细胞明显增加,CD8+T细胞略有增加。CD4+/CD8+的比率明显增加,CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比率明显下降,差异有统计学意义。结论6B11ScFv-mHSP70融合蛋白在体外可诱导特异性抗卵巢癌的细胞免疫反应,有可能作为抗独特型疫苗用于卵巢癌的主动免疫。
- 刘春雨崔恒昌晓红叶雪付天云程洪艳张果熊英成夜霞张丽赵旸
- 关键词：抗独特型抗体热休克蛋白融合蛋白卵巢癌
