国家自然科学基金(81370228)
- 作品数：7 被引量：30H指数：4
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- 相关机构：首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所华中科技大学更多>>
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- 绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较被引量：1
- 2014年
- 目的：探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞（ MSCs ）的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法：应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点，运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力，台盼蓝法测定细胞传代成活率，采用流式细胞术测定2种第3代（ P3）细胞DNA周期及表面标志物的表达，并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果：酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后，细胞贴壁呈成纤维形，2 d后呈漩涡状生长且增殖明显，3 d后达80％融合即可传代；应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs，体外培养4 d后，细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长，5 d后呈克隆样生长且增殖明显，7 d后达80％融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形，骨髓MSCs 生长曲线较平缓；MTT法显示脐带MSCs在3～5 d增殖较明显，骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96％以上，G0／G1期细胞均为85％以上，无明显差异（P＞0．05）；2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为（60．7±2．3）％以上高表达，CD45、CD19、CD14和CD79a均为（25．6±4．8）％低表达，两者无明显差异（ P＞0．05）；2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能，脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90％以上，与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异（ P＜0.05）。结论：脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。
- 辛毅李娜张颖黄益民刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：脐带间充质干细胞生物学特性绿色荧光蛋白转基因小鼠
- 人脐带间充质干细胞外泌小体保护缺氧复氧损伤的心肌细胞被引量：10
- 2016年
- 目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)外泌小体对心肌细胞缺氧复氧损伤后细胞凋亡的作用,并分析外泌小体内具有心脏保护作用的微小RNA(microRNA,miRNA)表达水平。方法:酶消化法培养HUMSCs并对其免疫表型进行流式细胞术鉴定;收集培养的第3代HUMSCs上清液,利用试剂盒提取外泌小体,电镜观察其形态结构,并采用Western blot法鉴定试剂盒所提物质CD63蛋白水平的表达;用提取的外泌小体处理缺氧复氧条件下的心肌细胞,流式细胞术Annexin V-FITC/PI标记法观察外泌小体对心肌细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测外泌小体中miRNA的表达水平;miR-22抑制剂处理缺氧复氧条件下的心肌细胞,流式细胞术检测心肌细胞的凋亡。结果:流式细胞术检测第3代HUMSCs的CD105、CD73和CD90呈高表达,而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR的表达阳性率低,说明第3代培养的HUMSCs具有间充质干细胞的特异性表型特征。向骨细胞分化诱导HUMSCs,钙结节形成明显,经茜素红染色呈红色结节,分化率为(92.5±5.1)%以上。经向脂肪细胞分化,细胞见脂滴形成,油红染色将脂滴染成红色,分化率为(91.6±3.8)%以上,说明第3代培养的HUMSCs具有间充质干细胞的多向分化能力。扫描电镜观察可见外泌小体球状结构,并且外泌小体特异性蛋白CD63表达强阳性。缺氧复氧导致心肌细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。在缺氧复氧条件下,外泌小体处理使心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。不同浓度外泌小体处理心肌细胞,其抗细胞凋亡作用无明显变化(P>0.05)。实时荧光定量PCR检测外泌小体中富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139-5p,其中miR-22表达水平最高;在缺氧复氧条件下miR-22抑制剂处理心肌细胞,细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论:人脐带间充质干细胞外泌小体可有效减少缺氧复氧条件下的心肌细胞凋亡,其抗凋亡
- 李佳辛毅崔巍刘飒黄然然陈娟周洁李娜
- 关键词：人脐带间充质干细胞微小RNA心肌细胞缺氧复氧
- 小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究被引量：7
- 2014年
- 目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。
- 辛毅李娜黄益民刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：骨髓间充质干细胞血管内皮细胞诱导分化小鼠
- 大鼠静脉多次注射人脐带间充质干细胞安全性的研究被引量：4
- 2015年
- 目的：观察多次静脉输注人脐带间充质干细胞（hu MSCs）对大鼠的毒性反应。方法：1贴块法培养hu MSCs;流式细胞仪鉴定第4代hu MSCs特异性表面抗原;标准试剂盒鉴定第4代hu MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能;2182~203g的SD大鼠分为对照组、0.9%氯化钠组和干细胞组,各8只,雌雄各50%。3干细胞组分别于第1、4和15天时经尾静脉注射（2.5×106）个/kg体质量的第4代hu MSCs,0.9%氯化钠组于同等时间注射与细胞悬液等量0.9%氯化钠液。4第3次注射转染RFP基因（中文）的hu MSCs后11天,腹主动脉取血,检测和比较血常规和生化指标;取脑、心、肺、肝及肾进行病理学检查;荧光显微镜观察器官组织中表达RFP的hu MSCs细胞分布情况,流式细胞仪检测骨髓中表达RFP的hu MSCs;ELISA检测血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及IL-12含量。结果：1第4代hu MSCs特异性表面抗原CD73、CD90和CD105表达强阳性,纯度分别为98.7%、99.6%和98.6%,而CD34、CD45、CD11b、CD19、CD79a和HLA-DR的表达水平为阴性,CD14表达水平为23.1%;hu MSCs分化成脂细胞和成骨细胞的比例均为99%;2注射3次干细胞后实验动物全部存活,干细胞组部分血常规和生化指标与0.9%氯化钠组相比有差异,但与对照组相比,只有PLT明显降低、CHOL明显升高;3干细胞组脑、心、肺、肝、肾的形态和组织病理学无明显改变;（4）干细胞组的器官组织和骨髓中未检测到表达RFP的hu MSCs;（5）干细胞组血清IL-8水平明显升高。结论：多次尾静脉注射hu MSCs对大鼠没有明显的毒性反应。
- 张颖李娜林筝辛毅崔巍刘飒王忠陈雄赵颂军袁惠黄益民周玉杰罗毅张兆光
- 关键词：人脐带间充质干细胞毒性反应
- 脐带间充质干细胞源外泌小体减轻糖尿病模型小鼠心肌纤维化被引量：3
- 2018年
- 目的:探讨脐带间充质干细胞外泌小体对糖尿病模型小鼠心肌纤维化的保护作用。方法:6~8周C57BL/6雄性小鼠随机分为3组:对照组、糖尿病模型组和糖尿病+外泌小体组。采用高脂饮食连续喂养5周后,联合小剂量多次(45 mg/kg,每周1次,连续5周)腹腔注射链脲佐菌素的方法诱导糖尿病(血糖≥16.7 mmol/L)模型。糖尿病+外泌小体组在糖尿病造模后,经尾静脉每周注射1次外泌小体,连续注射4周;对照组和糖尿病组予等体积的生理盐水连续注射4周。利用小动物彩色多普勒超声诊断仪检测小鼠心功能指标;然后取腹主动脉血,用生化比色法检测葡萄糖和游离脂肪酸的含量;同时取心脏组织,HE染色观察心肌纤维的结构变化;Masson染色观察心肌纤维化水平。结果:超声心动图结果显示,与对照组相比,糖尿病组较对照组的左心室舒张末期内径和左心室收缩末期内径增大(分别P<0.05和P<0.01),射血分数和室壁缩短率下降(P<0.01);糖尿病+外泌小体组较糖尿病组的左心室收缩末期内径减小,心室扩张减小,射血分数和室壁缩短率提高(P<0.01)。生化比色法检测血糖及血浆游离脂肪酸结果显示,与对照组相比,糖尿病组血糖及血浆游离脂肪酸水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.01);糖尿病+外泌小体组可显著降低血糖及游离脂肪酸水平,差异有统计学意义(P<0.01)。HE染色结果显示,对照组心肌细胞完整,排列整齐;糖尿病组心肌细胞出现肥大、断裂;糖尿病+外泌小体组心肌细胞较完整,排列较整齐。Masson染色结果显示,与对照组相比,糖尿病组纤维化面积显著增大,差异有统计学意义(P<0.01);与糖尿病组比较,糖尿病+外泌小体组纤维化面积减小,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:局部注射人脐带间充质干细胞外泌小体可以减轻糖尿病小鼠心肌纤维化,并改善心脏功能。
- 黄然然辛毅林筝李娜
- 关键词：人脐带间充质干细胞糖尿病心肌病心肌纤维化
- 构建高生物相容性干细胞心脏补片的研究
- 2015年
- 目的:去细胞化处理脐动脉构建生物支架,将小鼠脐带胶样组织间充质干细胞(MCS)种植到生物支架上构建心脏补片,移植到小鼠心肌梗死区域观察其生物相容性。方法:1联合应用胰酶和胶原蛋白酶处理小鼠脐带动脉组织构建生物支架;2体外分离并培养小鼠脐带MCS至第三代,种植到生物支架构建心脏补片;3移植到野生型小鼠皮下3天后观察免疫反应;4移植到小鼠心肌梗死区域,观察其与原位心肌的融合和血管新生。结果:脱细胞化处理后的脐带动脉组织在电镜观察下显示为富含多孔隙的纤维支架;荧光染色观察MSC种植到支架上深入生长到支架的内部并黏附生长;去细胞化处理未明显改变脐动脉组织的含水比例[(95.3±1)vs.(94.9±0.6),P>0.05];与对比组比较,去细胞化处理导致组织支架的断裂牵张力显著降低[(0.24±0.0)vs.(0.15±0.06)m Pa,P<0.05]。但是去细胞化处理未明显改变脐动脉组织的断裂变形率[(45±15)vs.(53±10)%,P>0.05];将裸支架和种植了干细胞的组织补片分别种植于C57野生小鼠的皮下,3日后切片染色,荧光显微镜下观察裸支架移植后局部CD+4淋巴细胞为(15±2.4)%,而干细胞补片内仅见少量CD+4的细胞浸润[(1±0.4)%,P<0.05]。将干细胞补片移植到小鼠急性心肌梗死区1周后,发现补片与原位心肌的融合性良好,补片内部有大量的新生血管生成。结论:成功构建心脏补片;移植到小鼠具有较高的生物相容性,并与原位心肌融合性好并有新生血管形成,为急性心肌梗死的干细胞治疗提供了实验依据。
- 李娜李佳辛毅张晓霞崔巍林筝黄益民周洁孔晴宇
- 关键词：间充质干细胞脐动脉生物相容性心肌梗死
- 人脱细胞脐动脉支架与兔骨髓内皮祖细胞构建组织工程血管的实验研究被引量：6
- 2014年
- 目的:构建小口径组织工程生物血管并观察移植于兔颈动脉后的通畅情况。方法 :制备人脐动脉脱细胞支架,随机分为三组:Ⅰ.实验组:将兔皮肤成纤维细胞、下肢动脉平滑肌细胞和骨髓内皮祖细胞依次接种于纤维连接蛋白包被的血管支架上;Ⅱ.对照组:血管支架未经纤维连接蛋白包被,种植细胞种类同实验组;Ⅲ.裸支架组:未经处理的脱细胞裸支架。行HE染色观察种植细胞情况;免疫组化染色鉴定种植细胞的表型;电镜下观察人工血管内皮细胞间的连接状态。将人工血管分别移植于兔颈动脉,术后0h、2h、1d、2d、3d、7d、14d及30d后行血管超声检查,对三组移植血管通畅程度进行比较。结果:植入细胞后的人工血管动态培养2w后,Ⅰ组血管在倒置显微镜可见管腔内大量细胞附着、细胞呈密集环绕生长,HE染色结果显示:血管管腔内层均匀覆盖细胞;免疫组化染色其结果显示:管腔内层细胞高表达成熟内皮细胞表面标志CD34;扫描电镜观察血管腔内较为均匀的覆盖细胞,血管壁较为光滑呈膜性结构。Ⅱ组血管在倒置显微镜下和HE染色均未见附着的细胞;免疫组化染色显示管腔内层细胞不完整;扫描电镜观察血管腔内少量细胞覆盖,血管壁为不规则的纤维状结构。兔颈动脉移植术后立即行血管超声检测,结果显示实验组血管的内径为(3.97±0.2)mm,血流通畅,与裸支架组的(3.88±0.2)mm及对照组的血管内径(4.14±0.6)mm相比,差异无统计学意义(P>0.05);2h血管超声检测结果显示,实验组(3.81±0.7)mm与对照组(1.89±0.2)mm的血管内径有显著性差别(P<0.05),后者明显狭窄,出现血栓。30d后实验组血管内径(2.50±0.2)mm与移植0h比较显著狭窄(P<0.05)。结论:人脐动脉脱细胞支架与兔骨髓内皮祖细胞构建的组织工程生物血管移植于兔颈动脉可长期通畅。
- 汪川李京倖辛毅李娜刘硕张帆白辰
- 关键词：细胞种植血管移植
