广东省科技计划工业攻关项目(2006B36008015)
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
- 相关作者：张园易绍东董凤英邱健李志樑更多>>
- 相关机构：广州军区广州总医院南方医科大学更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组人组织因子RNA干扰穿梭载体的构建及其体外鉴定
- 2009年
- 目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建携带发夹结构的TF-shRNA的穿梭表达载体。方法在以往研究的基础上,设计具有小发夹结构的TF-shRNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至pShuttle Vector1.0-CMV,转化E.coli DH5a菌株,提取重组穿梭质粒行酶切鉴定和测序,RT-PCR法检测其沉默TF基因的效果。结果成功构建了携带TF-shRNA的穿梭表达载体,经限制性内切酶酶切和测序软件分析证实,与设计序列同源性达98%以上;采用多重比较进行统计学分析结果显示,重组质粒pShuttle-TF-shRNA能显著性降低293细胞中TFmRNA表达,转染后24,48和72h细胞中TFmRNA表达含量显著降低,有统计学意义(P=0.000)。结论成功构建了针对人TF基因的穿梭表达载体,为将TF作为治疗靶点提供了实验基础。
- 张园李志樑邱健易绍东董凤英
- 关键词：基因沉默
- 优化阳离子脂质体介导的组织因子小干扰RNA转染HEK-293的转染条件被引量：4
- 2009年
- 目的:优化lipofectamine^(TM)2000介导的组织因子(TF)小干扰RNA(siRNA)的转染条件。方法:化学合成法合成特异的TFsiRNA,利用绿色荧光蛋白(GFP)进行标记,分别将1.0μL和1.5μL的lipofectamineTM2000与含有20、30、40、50、60pmol的TFsiRNA混合液制备成相应的转染混合物,转染人胚胎肾细胞株(HKE-293)24h后,在荧光显微镜下计数阳性细胞率。同时,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测每组细胞活性。结果:转染效率和细胞活性与lipofectamineTM2000以及siRNA有明显的交互作用,在1.0μL的lipofectamineTM2000和50pmolsiRNA转染HEK-293细胞时,细胞转染效率最高,转染效率达(86.5±2.4)%,在1.5μL的lipofectamineTM2000转染40pmolsiRNA时,细胞活性为(86.0±7.8)%。结论:经优化转染条件后的li-pofectamineTM2000可高效的将化学合成的siRNA转染入HKE-293细胞株,且细胞活性达85%以上,为建立稳定的沉默转染体系提供实验基础。
- 张园李志樑邱健易绍东董凤英
- 关键词：阳离子脂质体小干扰RNA转染
