国家自然科学基金(30771997)
- 作品数：2 被引量：6H指数：1
- 相关作者：邱实谭晓华马晶莹陈鹏陈媛媛更多>>
- 相关机构：第三军医大学北京军区总医院武警北京总队医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- EGFP-CD40L融合基因的构建、表达及功能鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型和功能的影响。方法以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段。小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L。用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达。Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌。结果 pcDNA3.1sEGFP或pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Westernblot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白。sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响。结论用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌。
- 马晶莹谭晓华陈媛媛邱实
- 关键词：绿色荧光蛋白质类CD40配体树突细胞白细胞介素12
- 5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较被引量：5
- 2009年
- 背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要。目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率。设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成。材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病。方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性。用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察。主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例。结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%。人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14d油红O染色均为阳性。Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%;后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%。在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上。在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下。结论:Ad5/F35
- 陈鹏谭晓华马晶莹邱实
- 关键词：骨髓间充质干细胞腺病毒载体转染效率
