国家科技重大专项(2012ZX09102301-008)
- 作品数：10 被引量：14H指数：3
- 相关作者：吴祖泽靳继德于爱平刘玉斌王文文更多>>
- 相关机构：军事医学科学院天津大学北京工业大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生理学更多>>
- 大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺
- 2016年
- 为建立可产业化的大肠杆菌表达的重组新蛭素(neorudin,EH)生产工艺,主要采取从低密度到高密度发酵的优化思路,优化了发酵罐培养基和诱导时间;比较了超声破碎和反复冻融的目的蛋白提取方法;纯化工艺采用离子交换层析2步法进行:SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Source 15Q阴离子交换层析;所得产品用免疫印迹法鉴定,经HPLC检测纯度,凝块法检测抗凝比活性;最后对纯化产品进行结构确证,包括高分辨率质谱、C-末端测序、N-末端测序、二硫键分析.结果显示:优化后的发酵工艺确定基于TB培养基的高密度发酵工艺,菌体OD_(600)可达40左右,每升菌体湿质量可达70 g左右,目的蛋白表达量约400 mg/L;菌体反复冻融离心上清经过纯化获得的目的蛋白HPLC纯度均大于97%,纯化收率为26.12%,抗凝比活性为1 024 ATU/mg,用高分辨率质谱检测其分子质量约为7 415.188 0 ku,N-末端、C-末端和二硫键均与理论相符.建立了EH在大肠杆菌中的高密度发酵和纯化工艺.
- 吴祖泽郭莹莹刘玉斌郭彦梅董俏言靳继德姚敏于爱平
- 关键词：大肠杆菌高密度发酵离子交换层析抗凝活性
- 重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定被引量：5
- 2013年
- 目的：通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白（EH）的中试发酵工艺，为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法：首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线，然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的D_600nm值、溶氧值（D02）及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白；表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果：发酵结束时，上清中蛋白含量达1．41g／L，经后期分离纯化，得到约21gEH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13．2×10^3±0．2×10^3，质谱分析相对分子质量约为7.3×10^3±0．73×10^3；Western印迹表明检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95％；凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512～1024ATU／mg。结论：建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。
- 郝木强李彦英刘春杰王秀冬刘晶晶李艳琪刘洋刘洋吴祖泽
- 关键词：水蛭素重组蛋白毕赤酵母中试放大
- 谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素抑制血栓形成的实验研究被引量：5
- 2013年
- 目的观察新型水蛭素衍生物谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素在体内外的抗栓作用。方法通过发色底物法体外检测谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素被凝血因子Xa裂解前后的抗凝血酶活性变化,同时通过大鼠颈动脉血栓模型和大鼠后腔静脉血栓模型,进一步验证谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素在体内的抗栓效果及其低出血的特点。结果体外实验显示,谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素只有被凝血因子裂解后,才产生抗凝血酶活性。大鼠颈动脉血栓模型和大鼠后腔静脉血栓模型实验结果显示,动物给予谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素后,血栓形成时间明显延长,血栓质量显著减小;同时对凝血参数影响较弱,动物出血时间、凝血酶原时间和凝血酶时间明显低于阳性对照药水蛭素和低分子肝素。结论新型抗凝蛋白谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素对动、静脉血栓的形成有明显的抑制作用,且出血副作用小于水蛭素和低分子肝素,为其进一步临床实验提供了重要的参考依据。
- 王文文徐向伟赵专友吴祖泽靳继德
- 关键词：水蛭素肝素血栓
- 重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究被引量：2
- 2014年
- 目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的c DNA,PCR产物连接入原核表达载体p ET-22或p ET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(ply Ss),获得重组工程菌BL21(DE3)-p ET-24-eh,BL21(DE3)-p ET-22-eh,BL21(ply Ss)-p ET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-p ET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD600=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。
- 张超巩蔚郭莹莹孙卫国姚敏于爱平
- 关键词：原核表达可溶性表达抗凝
- 注射用重组新蛭素的质量控制研究
- 2016年
- 目的:建立注射用重组新蛭素原液、成品的质量控制方法及内控质量标准。方法:利用纤维蛋白凝块法测定注射用重组新蛭素的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC测定纯度,SDS-PAGE和质谱法分析相对分子质量,免疫印迹验证目的蛋白,其余检测项目按《中华人民共和国药典》(2010年版三部)规定进行。结果:用建立的方法对注射用重组新蛭素3批原液和成品进行了检定,原液抗凝比活性均为512 ATU/mg,非还原型SDS-PAGE和HPLC检测3批原液的纯度结果均大于95%;质谱法分析3批原液相对分子质量符合7.3×103±0.7×103,SDS-PAGE分析3批原液相对分子质量符合13.2×103±1.3×103;免疫印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;其余各项指标均符合内控质量标准及《中华人民共和国药典》(2010年版三部)的要求。结论:建立的质量控制方法和内控质量标准可以用于注射用重组新蛭素的检定和质量控制。
- 毛赟赟李彦英董俏言赵宁李凯靳继德董晓杰
- 关键词：水蛭素生物学活性
- HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量被引量：1
- 2017年
- 目的建立HPLC技术定量测定发酵上清液中重组新蛭素(EH)含量的方法,用于监测发酵过程中EH的表达量变化与诱导时间的关系,使EH产量最大化。方法利用HPLC技术建立EH的检测方法,通过对该方法的灵敏度、精密度和加标回收率实验的考察,确立该方法的可行性;利用该方法对EH样品进行稳定性考察,并对酵母发酵上清液进行跟踪检测。实现了对发酵过程中发酵上清液中EH的实时监测。结果 EH在214 nm处有较强的特异性吸收峰,其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系,r^2=0.9995,EH线性浓度范围在0.012~4.8 mg/ml。该测定方法具有很好的精密度,样品多次重复测定的RSD值为1.4227%;加标回收率在95%~98%。应用该方法对EH样品的稳定性测定结果显示,样品4℃保存稳定性较好,24 h内样品主峰面积百分比>95%,在20℃条件下,8 h内样品稳定性良好,主峰面积百分比>95%。该方法准确度高、重复性好,进行测定时,可根据EH的特异吸收峰,对发酵过程中发酵上清液中EH含量进行实时定量测定。测定结果显示,在一定时间范围内,EH的表达量与诱导时间成正相关。结论本研究建立了HPLC技术检测EH含量的方法,该方法可用于发酵过程中EH的实时定量监测,使EH的产量达到最大值,为EH的临床样品制备提供有力支持。
- 刘玉斌刘玉斌于爱平吴祖泽吴祖泽
- 关键词：酵母表达系统高效液相色谱实时监测
- 利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究
- 2012年
- 目的通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y(carboxypeptidase Y,CPY)基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响。方法通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列;通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆。用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失。对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性;用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性。结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失。YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌。蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌。结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌。
- 王文文郝木强刘春杰靳继德吴祖泽
- 关键词：毕赤酵母羧肽酶基因敲除
- EH-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析
- 2017年
- 目的:为延长重组新蛭素(EH)的半衰期,制备通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1Fc的融合蛋白EH-LFc,并对其进行功能分析。方法:采用重叠PCR技术构建Eh-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pcDNA3.1,用脂质体将重组表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,G418抗性筛选稳定克隆株;Western印迹检测培养上清中EH-LFc蛋白的表达,用有限稀释法对G418抗性筛选出的混合克隆单克隆化,通过Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,Lowry法检测蛋白浓度,SDS-PAGE、HPLC法检测目的蛋白纯度,质谱法分析相对分子质量,凝血因子Ⅹa裂解融合蛋白后采用纤维蛋白凝块法测定其抗凝活性。结果:构建了重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc,并获得稳定表达EHL-Fc的细胞株。表达产物的相对分子质量为72 168,HPLC检测亲和层析获得的EH-L-Fc纯度达93.9%。完整的EH-L-Fc无抗凝活性,经凝血因子Ⅹa裂解后其抗凝比活性为96.6 ATU/mg。结论:获得稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株和较高纯度的重组融合蛋白,且该重组融合蛋白经凝血因子Ⅹa裂解后可释放抗凝活性。EH-L-Fc融合蛋白的获得为研究新蛭素的长效剂型奠定了重要基础。
- 庞玉红刘玉斌于爱平吕英涛
- 关键词：抗凝FC融合蛋白
- 新蛭素和人IgG-Fc融合蛋白的表达纯化和功能评价
- 2019年
- 新蛭素(EH)具有很好的抗凝血效果,但由于半衰期短限制了其在临床上的推广和应用.为延长EH的半衰期,制备人Ig G-Fc和EH的融合蛋白,并对其活性和药代动力学进行初步研究.将合成的Fc-EH和Fc-L-EH融合基因克隆至表达载体pc DNAHC上,再将重组表达载体转染CHO细胞.蛋白A亲和柱纯化融合蛋白,用SDSPAGE和WesternBlot鉴定蛋白表达情况,质谱法检测蛋白的分子质量和C端序列,体外凝块法和大鼠颈静脉血栓模型分别验证融合蛋白的体外抗凝活性和体内抗栓效果,应用化学发光免疫法检测融合蛋白半衰期.结果表明,成功构建了pc DNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH两个重组表达载体,融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH分子质量分别为68 476,u和70 542,u,蛋白的C端序列正确,Fc-EH和Fc-L-EH活性分别为256,ATU/mg和64,ATU/mg.大鼠颈静脉血栓实验表明,Fc-EH具有抗血栓作用,体内消除半衰期为39.4,h.融合蛋白Fc-EH能延长EH体内半衰期,为融合蛋白的进一步研究奠定了基础.
- 吴祖泽汪坤李世崇董晓娜窦桂芳葛志强葛志强
- 关键词：水蛭素抗凝活性FC融合蛋白
- UPLC-MS/MS法测定人尿液中新蛭素及其活性代谢产物水蛭素被引量：4
- 2020年
- 目的:建立同时测定人尿液中新蛭素及其活性代谢产物水蛭素的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法,用于注射用重组新蛭素Ⅰ期临床试验健康受试者尿液的药动学研究。方法:采用新蛭素的类似肽MEH作为内标,50μL尿液样品加入等体积的50μL空白人血清经300μL甲醇沉淀蛋白后,通过Waters BEH300 C18色谱柱(300,2.1 mm×50 mm,1.7μm)分离,柱温为40℃,流动相为水(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1,色谱运行时间为5 min,进样体积为5μL。采用电喷雾电离源正离子多反应监测检测。新蛭素,水蛭素和内标的监测反应质荷比(m/z)分别为1 042.4→1 280.4,1 152.1→1 352.8,1 063.3→1 332.1。对该方法的选择性与残留、标准曲线与定量下限、准确度与精密度、基质效应与回收率、稀释可靠性与稳定性进行了全面的验证。结果:新蛭素和水蛭素的线性范围均为10~2 000 ng·mL^-1,定量下限均为10 ng·mL^-1,新蛭素和水蛭素的批内和批间精密度为5.4%~13.9%和3.7%~12.2%,准确度为-6.6%^-0.2%;残留、基质效应与回收率、稀释效应与稳定性均在可接受的范围内。结论:该方法符合生物分析指导原则的要求,满足注射用重组新蛭素临床Ⅰ期药动学的尿液排泄研究。
- 董晓娜孟志云顾若兰朱晓霞甘慧靳继德窦桂芳
- 关键词：水蛭素
