广东省自然科学基金(36703)
- 作品数：13 被引量：22H指数：3
- 相关作者：周天鸿李月琴李弘剑张欣唐冬生更多>>
- 相关机构：暨南大学广州医学院第一附属医院安徽理工大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- DNA-EGS1386胞内诱导核酶P抑制人巨细胞病毒UL49基因的表达被引量：1
- 2009年
- 外部引导序列(EGSs)是一类与mRNA靶序列互补并能引导核酶P切割靶mRNA的小分子RNA。本实验构建稳定表达UL49基因的HeLa细胞系,设计合成了针对于人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的12ntDNA性质的EGS1386,通过转染稳定表达UL49基因的细胞系,荧光定量PCR和Western blotting检测细胞内目的基因UL49的表达情况。结果显示在DNA-EGS1386作用下UL49基因的表达量降低了50%,表明DNA-EGS1386可以有效引导人的核酶P切割目标mRNA。因此,DNA-EGS可以发展成为一种新的基因沉默技术和潜在的抗病毒试剂。
- 崔延伟曾志锋李弘剑李月琴周琪杨丹邹奕杨光周天鸿
- 关键词：基因沉默
- 引导RNase P对HCMV UL54 mRNA片段体外切割的EGS构建
- 2009年
- HCMV是一种广泛存在的疱疹病毒,在免疫抑制和免疫功能低下人群中,HCMV感染可引起严重疾病。RNase P是细胞内催化tRNA5′末端成熟的酶,当EGSs与靶mRNA互补结合并形成类似tNRA的复合物时,大肠杆菌RNase P催化亚基M1 RNA可具备对靶mRNA特异的催化切割活性。为研究抗病毒制剂,针对HCMV DNA多聚酶UL54 mRNA设计并构建特异性的EGS-C6,通过对UL54基因亚克隆片段转录产物体外切割研究,证实该EGS具备引导M1 RNA对UL54 mRNA特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂。
- 吕静竹李月琴周天鸿
- 关键词：RNASEP人巨细胞病毒
- 腺病毒介导的人巨细胞病毒UL49基因小鼠模型的建立被引量：1
- 2010年
- 建立表达HCMVUL49基因的转基因小鼠,为抗病毒药物研究提供有效的实验动物模型。将UL49-GFP基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建重组质粒pDC316-UL49-GFP,与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre通过脂质体介导共转染293细胞,重组产生腺病毒Ad-UL49-GFP,经PCR和Western blot鉴定正确后,大量扩增、纯化,制备高滴度重组腺病毒。纯化腺病毒经尾静脉注射感染小鼠,通过荧光定量PCR和Western blot方法,检测UL49基因在小鼠体内组织分布和表达时相。结果显示UL49基因在小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织均有表达,并且表达量由高到低顺序依次是:肝、脾、肾、心、肺,在腺病毒感染第3天在各靶器官表达水平较高,此后逐渐下降,第14天时仅存在肝和脾中。表明表达UL49基因的小鼠模型构建成功。小鼠模型的成功建立为下一步筛选以UL49基因为靶的抗病毒药物奠定了基础。
- 杨丹崔延伟李弘剑李月琴周琪曾志锋张欣杨光周天鸿
- 关键词：人类巨细胞病毒腺病毒载体动物模型
- RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用被引量：2
- 2004年
- 外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶。通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂。
- 周乐平李弘剑陈浩军李月琴何华坤王波周天鸿
- 关键词：MRNA
- 异基因造血干细胞移植后人巨细胞病毒感染临床毒株UL54基因的克隆及序列分析被引量：2
- 2005年
- 目的 研究异基因造血干细胞移植(AlloHSCT)后感染人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株UL54基因的克隆与鉴定。方法 从异基因造血干细胞移植后感染HCMV的患者体内分离出HCMV临床毒株,根据GenBank提供的实验室标准病毒株HCMVAD169UL54基因DNA全序列及有关文献,从该临床毒株DNA中扩增分离出UL54基因片段,并克隆入pEGM3Z载体。对重组体pEGM3Z UL54进行测序鉴定,并进行初步的序列分析。结果 从临床病毒株中扩增出约3728bp的片段,克隆产物经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定,证实为HCMVUL54基因,其序列保守区域与GenBank报道AD169基本一致,但在第519、618、723、910、1188、1641、2070、2278、2279、2442、3140等11个位点发生碱基突变,涉及到编码氨基酸C304R、T760N、Y1047C、R1054K等位点发生改变,其中T760N为UL54保守区域改变。结论 成功克隆出AlloHSCT后感染野生型人巨细胞病毒的UL54基因,初步的序列分析证实其存在11个碱基发生突变,并导致编码产物4个氨基酸位点发生改变。
- 田传军李月琴王波叶铁真张纯青苏运贞何华坤周天鸿
- 关键词：异基因造血干细胞移植人巨细胞病毒
- GS介导RNase P对人巨细胞病毒ul54基因mRNA的切割作用被引量：1
- 2006年
- 引导序列(Guide Sequences,GSs)是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus,HCMV)ul54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶。通过对ul54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的ul54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对ul54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础。
- 李弘剑黎景光苏运贞陈浩军李月琴叶飞舟张欣周天鸿
- 关键词：RNASE荧光定量PCR
- 人工核酶M_1GS结构与功能相互关系的研究被引量：3
- 2006年
- 目的:研究核酶M1GS其二级结构与体外切割活性之间的关系。方法:以人巨细胞病毒(HCMV)DNA聚合酶基因UL54为靶基因,构建了人工核酶M1GS-T7。通过软件RNAstructure对M1GS在3个具有相对稳定结构的温度(20℃、37℃、55℃)的空间构象进行模拟,然后通过体外切割实验来检测不同温度下核酶M1GS体外切割活性的变化。为一步研究核酶M1GS二级结构与体外切割活性之间的关系,参照温度变化实验结果及RNA二级结构的模拟结果,引入突变位点,构建了在37℃与55℃时M1GS-T7具有相同二级结构的突变型核酶mM1GS-T7,并通过体外切割实验对两者的活性进行比较。结果:在温度变化实验中,55℃核酶的体外切割活性最高。而在突变实验中,37℃mM1GS-T7比M1GS-T7的活性略高。结论:具有某种特定二级结构的M1GS-T7有相对较高的体外切割活性,核酶的结构与其功能之间存在一定的对应关系。
- 李弘剑孙亮李月琴郑永霞唐冬生张欣周天鸿
- 关键词：温度突变
- 桥序列在构建人工核酶M1GS中的作用被引量：5
- 2005年
- 目的:为检验连接的GS序列是否会影响M1RNA高级结构而导致M1RNA活性改变,对核酶的催化机制进行探讨。方法:通过软件模拟对M1GS进行结构分析,筛选了一段独立折叠的桥序列连接M1RNA与GS ,并通过体外切割实验检验有桥和无桥序列的核酶的活性。结果:有桥序列的M1GS具备体外特异切割底物的核酶活性,而无桥序列的M1GS核酶未表现体外切割活性。
- 郑永霞李弘剑李月琴陈浩军唐冬生张欣周天鸿
- 关键词：核酶人巨细胞病毒
- 对HCMVUL54 mRNA片段特异性切割的M1GS构建被引量：4
- 2005年
- 人巨细胞病毒是一种DNA病毒,在人群中一般呈亚临床感染和潜伏感染。为研究病毒基因沉默工具和抗病毒制剂,以人巨细胞病毒UL54基因mRNA序列设计互补的外部引导序列,共价结合到大肠杆菌来源RNaseP催化核心M1RNA上,从而构建成M1GS-T6核酶。通过对DNA聚合酶UL54基因亚克隆片段转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54mRNA片段的特异切割能力。
- 吕静竹李弘剑陈浩军李月琴周天鸿唐冬生张欣
- 关键词：人巨细胞病毒RNASEP
- 改进型外部引导序列抑制人巨细胞病毒UL49基因的表达(英文)被引量：1
- 2009年
- 外部引导序列(EGS)技术(The EGS-based technology)是一种新型的基因沉默技术,能诱导内源性的核酶P(RNase P)对靶mRNA进行有效切割.以人类巨细胞病毒(HCMV)UL49基因mRNA片段为靶序列,基于前人实验基础上设计出更为精简与高效的改进型EGS(miniEGS),DNA片段长度仅为12bp.构建稳定表达HCMVUL49的细胞系,通过应用荧光定量PCR及Western印迹分别鉴定miniEGS对内源性UL49的抑制效率.结果显示,miniEGS能在HeLa细胞中能达到很高的转染效率(97.9%),并且在转染稳定表达UL49的HeLa细胞系后,发现UL49基因的mRNA与蛋白表达水平都出现明显下降(50%).研究表明,改进型的EGS序列不仅能有效抑制目的基因的表达,同时因其序列设计的精简性与高效性,可更好地应用到以后的抗病毒研究中.
- 周琪曾志锋李弘剑李月琴崔延伟杨丹邹奕杨光周天鸿
- 关键词：人巨细胞病毒基因沉默
