广东省自然科学基金(7004728)
- 作品数：5 被引量：13H指数：3
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- 鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析被引量：3
- 2013年
- 从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。
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- 关键词：免疫原性
- 传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备
- 2009年
- [目的]构建传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。
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- 关键词：纯化抗体
- 鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证被引量：3
- 2009年
- 将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS)。结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50μg/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50μg/尾免疫组及100μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%。研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好。
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- 关键词：传染性脾肾坏死病毒免疫保护
- 鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白A基因的克隆及其生物信息学分析被引量：1
- 2013年
- 目的克隆鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因,并进行生物信息学分析。方法根据已发表的细菌ompA序列,通过比对保守区域(88~107 bp,988~1 007 bp)设计简并引物,通过PCR技术从鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株扩增ompA基因核心序列,采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法扩增ompA基因全长及其上下游序列;应用Vector NTI 9.0对ompA序列进行拼接,应用Vector NTI 9.0、SignalP 3.0对OmpA蛋白的基本参数、信号肽等进行预测分析;通过Blastn分析嗜水气单胞菌GYK1株ompA基因序列与其他菌种ompA序列的同源性,并构建系统进化树及对其蛋白的三维结构进行分析。结果ompA基因全长为2 004 bp,其中包括ORF 1 059 bp,编码352个氨基酸,5′端侧翼序列271 bp,3′端侧翼序列574 bp;OmpA蛋白相对分子质量约37 900,等电点为4.94,OmpA蛋白序列N-末端的前20个氨基酸残基为信号肽序列;根据22种细菌的OmpA蛋白序列构建的系统进化树显示,嗜水气单胞菌GYK1株与嗜水气单胞菌SSU株的亲源关系最近,相似性达95.5%;三维结构分析表明,OmpA蛋白N-末端功能区是由8个反向平行的β-折叠片构成的β-折叠桶;OmpA蛋白Asn25~Ala205片段4个环区的平均柔性显著高于其余部位的柔性。结论成功克隆了鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株ompA基因,并对OmpA蛋白的相关生物信息学进行了分析,为嗜水气单胞菌呈递外源蛋白基因工程疫苗的研究奠定了基础。
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- 关键词：嗜水气单胞菌外膜蛋白A基因克隆生物信息学
- 鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化被引量：7
- 2012年
- 菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。
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- 关键词：鳗鲡迟缓爱德华氏菌
