国家科技重大专项(2009ZX09102-221)
- 作品数：5 被引量：12H指数：3
- 相关作者：许正宏更多>>
- 相关机构：江南大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项江苏省科技支撑计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量被引量：7
- 2011年
- 为实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH)的规模化制备,通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-ggh,并电转至经载体pPIC9K-ggh异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用免疫学方法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,在30℃,3%甲醇诱导80 h后GGH的表达量达到了491 mg/L,较GS115/F2提高了49.7%,通过荧光定量PCR发现GGH基因拷贝数在含有双质粒体系的GS115/F3中较出发菌株GS115/F2提高了26.7%。Western blotting杂交表明融合蛋白同时具有人血清白蛋白和人胰高血糖素样肽-1的抗原性。
- 王慧窦文芳张晓梅许泓瑜许正宏
- 关键词：毕赤酵母荧光定量PCRWESTERNBLOTTING
- 重组白蛋白人胰高糖素样肽-1突变体的串联体的融合蛋白在小鼠体内的药代动力学被引量：4
- 2011年
- 目的研究重组白蛋白融合人胰高糖素样肽突变体的串联体rh(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)在小鼠体内的药代动力学特性。方法采用氯胺T法标记目标蛋白rhGGH,γ放射免疫计数器检测三氯醋酸(TCA)沉淀前后血浆、组织、尿和粪的放射性计数,用DSA1.0软件拟合药物动力学模型,并计算相应动力学参数。结果 125I-rhGGH单次单剂量皮下注射后在小鼠体内的动力学过程符合二室模型,分布容积为53.4 mg.L-1.h-1,体内吸收相半衰期T12α为26.6 h,体内消除相半衰期T12β为57.8 h。125 I-rhGGH在小鼠甲状腺、血、胃、肝、肾、肺等组织器官中有较高的放射性摄取,而心、脑、胰腺、脾其它组织中放射性活度较小。125I-GGH主要经肾由尿排泄,给药后306 h,79.3%的药物由尿排出。结论小鼠体内的药代动力学表明rhGGH体内的半衰期明显优于非融合人胰高糖素样肽-1,因而使用rhGGH可以减少给药次数,并有可能提高疗效。
- 窦文芳许正宏张晓梅许泓瑜雷楗勇金坚
- 关键词：药代动力学血药浓度排泄小鼠
- 基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化
- 2012年
- 以毕赤酵母人β干扰素表达体系为研究对象,考察与蛋白酶活性相关的营养和环境因素对外源蛋白hIFN-HAS表达/降解的影响。结果表明,pH、谷氨酸和EDTA是显著影响hIFN-HAS表达的3个因素。通过响应面分析得到hIFNβ-HAS表达的最优条件为pH 5.5、谷氨酸0.18%、EDTA 12 mmol/L,目的蛋白表达量为24.46 mg/L。发酵终产物的电泳结果表明:条件优化后,hIFNβ-HSA降解带明显变淡,说明营养和环境因素的优化一定程度上抑制了蛋白酶的活性,由此增加了目的蛋白的积累。
- 张旦旦窦文芳许正宏史劲松
- 关键词：毕赤酵母Β干扰素融合蛋白蛋白酶酶活性
- 融合蛋白GGH在小鼠体内的药效学评价被引量：1
- 2011年
- 目的探讨融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)对实验性β细胞轻度损伤的小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和胰岛功能的影响。方法对小鼠进行造模,血糖仪测定FBG,胰腺组织切片行HE染色,建立β细胞轻度损伤模型小鼠。实验分为正常对照组(normal control group,NC)、模型对照组(model group,DM)、GLP-1对照组、HSA对照组、Exendin-4(Ex-4)阳性对照组、GGH低(2 mg.kg-1)、中(6mg.kg-1)、高(18 mg.kg-1)剂量组(GGH 2、GGH 6、GGH18)治疗。记录14 d内的饮食、饮水、尿量、体重及FBG变化,放射免疫分析法测定空腹血清胰岛素水平(fasting seruminsulin,FINS),免疫组化方法观察胰岛β细胞增殖。结果 C57BL/6♂小鼠单剂量腹腔注射STZ 120 mg.kg-1 14 d后可成功制备稳定敏感的β细胞轻度损伤模型;治疗14 d,GGH中、高剂量组与DM组、GLP-1组、HSA组比较饮食、饮水、尿量减少(P均<0.05),FBG降低(P均<0.01),FINS升高(P均<0.05),胰岛细胞增殖增加(P均<0.05),GGH高剂量组的FBG、FINS与NC组、Ex-4组比较差异均无显著性(P均>0.05),胰岛细胞增殖与Ex-4组比较差异无显著性(P>0.05)。结论融合蛋白GGH通过促进β细胞的增殖和胰岛素的分泌而降低模型小鼠的高血糖,改善"三多一少"症状,其中GGH高剂量组的降糖药效与GLP-1受体激动剂Ex-4接近。
- 范翰李现丽窦文芳杜斌邱丽颖金坚许正宏
- 关键词：小鼠Β细胞损伤GLP-1融合蛋白降糖
- 融合蛋白(GLP-1_(A2G))_2-HSA的分离纯化及其活性评价被引量：4
- 2010年
- 建立简便、快速、高效的重组人血清白蛋白与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)突变串联体融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)的分离纯化方法。重组毕赤酵母菌株发酵产生的融合蛋白GGH的上清液通过超滤、染料配体亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析获得高纯度的样品,终回收率为33.1%,12%SDS-PAGE和HPLC检测纯度达到98%。体内活性测定结果表明,融合蛋白GGH在小鼠皮下给药8 h后仍能发挥显著的降血糖作用。结果表明建立的分离纯化方法较好的保留了融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的生物活性。
- 李现丽窦文芳张晓梅许泓瑜邱丽颖金坚许正宏
- 关键词：胰高血糖素样肽-1融合蛋白活性测定
