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国家自然科学基金(30670116): 作品数：11 被引量：33H指数：4; 相关作者：师长宏张廷芬赵勇张海岳晨莉更多>>; 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院西北农林科技大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划陕西省自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生更多>>

结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性研究被引量：2: 2008年; 目的研究结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性。方法用原核表达的Rv1009结构域多肽免疫BALB／c小鼠3次，每次间隔2周。用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激后，用MTF比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数。ELISA方法检测淋巴细胞悬液中γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-10和IL-12的产生水平。另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv，4周后，计数脾脏细菌负荷数。结果Rv1009结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1：12800。淋巴细胞增殖指数为2．40±0．18，明显高于生理盐水对照组的0．90±0．21。ELISA方法检测Rvl009结构域多肽免疫组IFN-γ IL—10和IL-12水平为（1432±30）ng／L、（503±11）ng／L和（311±11）ng／L，显著高于生理盐水对照组的（256±20）ng／L、（76±6）ng／L和（56±8）ng／L（P〈0．01）。与生理盐水免疫组（细菌负荷6．64±0．13）相比较，Rv1009结构域多肽免疫组小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用（细菌负荷为4．86±0．14，P〈0．05），但不及BCG免疫组的3．81±0．16。结论Rv1009结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分。; 樊爱琳师长宏苏明权简文程晓东柏银兰徐志凯郝晓柯; 关键词：细菌蛋白质类细胞因子类

结核分枝杆菌热休克蛋白16．3及其合成肽诱导小鼠免疫应答的研究被引量：3: 2009年; 目的比较MTB的热休克蛋白（HSP）16．3和HSP16．3合成肽在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法80只BALB／c小鼠分为5组，3个实验组：蛋白组：HSP16．3／溴化二甲基双十八烷酸铵（DDA）／单磷酰脂质A（MPL），合成肽组：HSP16．3合成肽／DDA／MPL，佐剂组：HSP16．3合成肽／弗氏不完全佐剂组；2个对照组：卡介苗组和生理盐水组。每只小鼠蛋白和合成肽免疫剂量为50μg／次，共免疫3次，间隔2周。卡介苗为单次免疫5×10^6CFU／只。分别于第1次免疫后0、2、4、6、8周采集血液，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中抗HSP16．3的抗体浓度及第8周时血清中抗体滴度。末次免疫完成后4周，每组取8只小鼠分离脾淋巴细胞，用HSP16．3刺激后，噻唑蓝法测定脾淋巴细胞的增殖指数，夹心ELISA法检测相同抗原刺激下脾淋巴细胞诱生的γ-干扰素水平。每组剩余小鼠用10’CFU的H37Rv毒株攻击，4周后取小鼠脾脏和肺脏，组织匀浆，倍比稀释后涂7H10平板，4周后计数菌落数。采用LSD-t检验统计学分析。结果抗HSP16．3抗体在免疫的前4周均增长迅速，之后趋于缓和。免疫8周时，3个实验组（蛋白组、合成肽组和佐剂组）抗体水平分别为1：2000、1：2000和1：1000，均高于卡介苗组（1：500）。3个实验组（蛋白组、合成肽组和佐剂组）的脾淋巴细胞增殖指数（3．13±0．18、3．21±0．21和2．40±0．15）均显著高于卡介苗组（1．67±0．12）和生理盐水组（1．04±0．09），蛋白组和合成肽组均显著高于佐剂组。3个实验组诱生的γ-干扰素水平·（182±6）、（194±9）和（179±8）mg／L]均显著低于卡介苗组[（275±10）mg／L]，高于生理盐水组[（71±3）mg/L]，3个实验组之间均无显著差别。3个实验组均对MTB在脾脏[细菌数为（6．74±0．14）-（6．81±0．28）lgCFU]和肺脏[细菌数为（5．74±0．27）-（6．65; 师长宏张廷芬朱德生张海白冰赵勇岳晨莉赵雷刘建利; 关键词：分枝杆菌结核热休克蛋白质类亚单位

结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究被引量：9: 2009年; 目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。; 刘建利师长宏靳亚平张海赵勇赵雷; 关键词：AG85B ESAT6 融合蛋白纯化

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响: 2009年; 目的表达纯化藤黄微球菌（Micrococcus luteus）复活促进因子（Rpf）及结构域（domain）蛋白，研究其对结核分枝杆菌生长的影响。方法诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT—Rpf和pPro—EXHT-Rpf domain，在变性条件下对目的蛋白进行纯化。用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长。结果获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95％和93％，相对分子质量（Mr）大小分别为30×10^3和12×10^3，蛋白质含量分别为471mg／L和337ms／L。Western blot证实，获得的蛋白为我们所需要的目的蛋白。所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长，而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长。结论表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长，而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性。; 樊爱琳简文郑善銮师长宏马越云杨麦贵柏银兰徐志凯郝晓柯; 关键词：藤黄微球菌结核分枝杆菌结构域

结核分枝杆菌HSP65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性被引量：2: 2008年; 目的:构建HSP65蛋白的亚单位疫苗和基因疫苗,并与BCG相比较,评价这两种疫苗在小鼠体内的免疫学特性.方法:从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出hsp65基因,连接进入pMD18-T载体中,测序后,利用不同酶切位点将完整的hsp65基因分别克隆到pProEX HTb原核表达载体和pcDNA3.1(-)真核表达载体,前者在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;后者通过阳离子聚合物瞬转P815细胞,用间接免疫荧光检测细胞内HSP65蛋白的表达.用上述原核表达蛋白和真核质粒(分别为亚单位疫苗和基因疫苗)免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度,MTT测定脾淋巴细胞特异性增殖指数.结果:获得的结核分枝杆菌hsp65基因序列与GenBank公布的完全一致;Western Blot结果显示,在Mr约65000处有与鼠抗HSP65 mAb和临床结核患者血清的特异性结合带;免疫荧光结果显示转染重组质粒的P815细胞的表达蛋白与HSP65 mAb有特异性结合.两种疫苗免疫小鼠体内产生特异性抗体,经蛋白刺激后可引起脾淋巴细胞特异性增殖.结论:所构建的两种疫苗能引起免疫动物的特异性体液和细胞免疫反应,应进一步研究其抵抗结核分支杆菌感染的保护力机制,以用于结核病的防治研究.; 席丽师长宏靳亚平张海张廷芬赵勇岳晨莉; 关键词：结核分枝杆菌热休克蛋白质类亚单位疫苗基因疫苗

Hsp16.3的生物学特性及其在结核病研究中的应用被引量：5: 2007年; Hsp16．3是由结核分枝杆菌（M.tuberculosis，MTB）hspX基因（Rv2031c、acr）编码的蛋白，最初被认为是免疫显性抗原，后来被确认是一个重要的膜抗原，它的表达与MTB的休眠密切相关。; 张廷芬师长宏; 关键词：HSP16.3 生物学特性结核病结核分枝杆菌膜抗原 MTB

结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定被引量：1: 2008年; 目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB Hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。; 席丽师长宏靳亚平张廷芬赵勇岳晨莉; 关键词：结核分枝杆菌 HSP65 表达纯化

结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断被引量：3: 2009年; 郭利民张廷芬师长宏; 关键词：结核分枝杆菌 TUBERCULOSIS 纯蛋白衍生物亚临床状态

结核分枝杆菌Hsp16.3的表达、纯化和鉴定被引量：11: 2007年; 目的克隆结核分枝杆菌hspx(acr、Rv2031c)基因,扩增后测序,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白Hsp16.3(Heat Shock Protein16.3)。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出hspx基因片段,连接进入pTA2载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProEX HTb并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白SDS-PAGE分析后,分别与6×His mAb、16k Da mAb和结核病人血清进行Western-blot,最后用Ni-NTA进行亲和层析纯化蛋白。结果获得结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白基因,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量与文献报道一致;Western-blot结果显示,在相对分子量约16kDa处有与6×His mAb和鼠抗16k Da mAb的特异性结合带,而与结核病人血清杂交没有出现结合带。表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白。结论成功地表达、纯化和鉴定了Hsp16.3蛋白,它有可能作为新型结核疫苗的靶抗原。; 张廷芬师长宏朱德生张海赵勇白冰; 关键词：结核分枝杆菌休眠

藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定被引量：5: 2008年; 目的克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子（Rpf）结构域及其突变体基因，评价其生物学活性。方法采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K，用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中，将测序正确的基因插入到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，经异丙基-β—D硫代半乳糖（IPTG）诱导，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达蛋白，利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析。用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白，将纯化的蛋白加入到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性。结果获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因，测序结果与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同，突变位点与设定一致；表达蛋白相对分子质量与文献报道一致；Western blot结果显示，在相对分子质量约32000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带。通过GS-4B系统，得到纯化的GST融合蛋白，并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用，突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用。结论获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白，明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用。; 岳晨莉史皆然师长宏张海赵雷张廷芬赵勇席丽; 关键词：突变体生物学活性

国家自然科学基金(30670116)

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