国家自然科学基金(30200359)
- 作品数：4 被引量：7H指数：2
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- 相关机构：第四军医大学西京医院第四军医大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 噬菌体改组库的构建及高活性水蛭素变异体的筛选被引量：1
- 2006年
- 目的:运用DNA家族改组方法提高水蛭素的抗凝血酶活性。方法:将水蛭素HV1、HV2、HV3基因等量混合,用DNaseI消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子,构建噬菌体展示的水蛭素改组文库,经凝血酶亲和淘选,ELISA筛选高活性的水蛭素变异体。结果:经过DNA改组和噬菌体亲和筛选,成功获得抗凝血酶活性提高的水蛭素变异体HV2-N47K。结论:用DNA家族改组及亲和淘选技术能够筛选出高活性的水蛭素变异体蛋白,这为其他分子的改组提供了借鉴。
- 龙铟刘家云刘莉王宗仁
- 关键词：水蛭素DNA改组
- 水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达被引量：1
- 2006年
- 目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达.方法:通过PCR扩增获得水蛭素HV2,HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2,pPIC9K-HV2-N47K.重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定.结果:成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性.结论:水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.
- 龙铟刘家云刘莉王宗仁
- 关键词：水蛭素毕赤酵母分泌表达
- 水蛭素基因DNA家族改组方法的建立被引量：2
- 2006年
- 目的:运用DNA家族改组技术,增加改组分子库的多样性。方法:取水蛭素HV1、HV2、HV3基因等量混合,用DNaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得水蛭素改组文库,DNA测序观察改组效果。结果:随机挑取3个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,表明改组分子库多样性较好,改组方法较为成功。结论:水蛭素基因DNA家族改组方法的成功建立为进一步筛选高活性的水蛭素奠定了基础。
- 龙铟刘家云刘莉王宗仁
- 关键词：水蛭素DNA改组基因
- 水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选被引量：4
- 2004年
- 目的 :构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体 ,获得高拷贝稳定整合菌株 ,为大量获得重组水蛭素蛋白 ,进行功能研究及其临床应用奠定基础 .方法 :根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子 ,设计HV1编码基因 ,分为 8条寡核苷酸片段进行DNA合成 ,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因 ,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游 ,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K ,得到pPIC9K HV1 ,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1 1 6 8,G4 1 8梯度筛选转化菌 ,PCR鉴定目的基因的整合 .结果 :获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K HV1 ,G4 1 8抗性筛选得到高拷贝菌株 ,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中 .结论 :成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体 ,获得了高拷贝稳定整合菌株 。
- 龙铟刘家云刘莉王宗仁
- 关键词：水蛭素毕赤酵母基因重组
