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中华大蟾蜍mcl-1基因克隆及其重组蛋白在原核体系中的诱导表达被引量：7: 2013年; 以蟾蜍（Bufo）为基原的常用中药材有蟾酥、蟾衣、蟾皮、干蟾等，具有强心、麻醉、解毒、止痛、抗菌、增强免疫力及抗肿瘤等药理作用，按溶解性可将其成分划分为脂溶性甾族类和水溶性吲哚生物碱类。体内外实验已证明由蟾皮制成的水溶性注射液——华蟾素具有良好的抗肿瘤效果。; 胡巧玲张姝芳杨仙玉余美华诸葛慧; 关键词：中华大蟾蜍原核表达重组蛋白

中华大蟾蜍gal-3基因多样性的原因分析被引量：2: 2013年; 使用TAKARA的SMARTer^(TM)RACE cDNA Amplification Kit和改进的Quantscript RT kit方法制备了3组源于同一中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)个体皮肤总核糖核酸(RNA)的第一链互补脱氧核糖核酸(cDNA),并以此为模板通过聚合酶链式反应(PCR,polymerase chain reaction)扩增半乳糖凝聚素3(gal-3)的全长开放阅读框(ORF,open reading frame),然后进行PCR产物的克隆、测序,再通过多种形式的序列比对分析该基因多样性产生的原因.从3组实验得到31个克隆,去除组内和组间重复出现的序列,共获得16个不同的cDNA.相同的序列,相同的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)以及相同位置相同数目的碱基缺失在3组独立的实验中重复出现,表明gal-3基因多样性.实际上,gal-3基因的多样性导致其编码蛋白的多样性.尽管如此,推导的氨基酸序列比对显示半乳糖凝聚素3糖基结合位点、磷酸化位点以及与其生物学功能关系密切的相关基序均高度保守,暗示中华大蟾蜍皮肤gal-3基因多样性的客观存在.; 潘李念万文彬张姝芳诸葛慧周品品杨仙玉; 关键词：中华大蟾蜍分子多样性

日本蟾蜍TAGLN2 cDNA的克隆与生物信息学分析被引量：5: 2013年; 为研究蟾蜍皮肤中多肽类有效成分,通过菌落PCR(polymerase chain reaction)对日本蟾蜍(Bufojaponicus formosus)皮肤cDNA质粒文库进行筛选,对测序结果进行分析及同源性比较,获得转胶蛋白-2(transgelin-2,TAGLN2)的5′端缺失的部分cDNA序列(GenBank登录号为JX197456),长为997 bp,包括348 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)、5'端31 bp及3'端618 bp的非翻译区(untranslated region,UTR),编码由115个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列含有一个调宁蛋白同源性结构域(calponin homology,CH)、两个可形成二硫键的半胱氨酸残基、3个α螺旋区域和5个潜在的磷酸化位点。氨基酸序列同源性分析显示,本文获得的日本蟾蜍N-端截短型TAGLN2与热带爪蟾(Xenopus(Silurana)tropicalis)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)相对应部分的同源性分别为90%和89%,与其他7种动物的同源性介于71%～85%之间。; 诸葛慧袁进强张姝芳杨仙玉; 关键词：基因克隆生物信息学分析

日本蟾蜍聚集素cDNA的克隆与序列分析被引量：5: 2013年; 为研究蟾酥、蟾衣、蟾皮中多肽类有效成分,通过菌落PCR对日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)皮肤cDNA质粒文库进行了筛选,获得了聚集素(clusterin,CLU)全长cDNA序列(GenBank登录号为JX035891)并对其进行了生物信息学分析。日本蟾蜍clucDNA全长为1 616 bp,包括1 332 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)、5'端30 bp及3'端254 bp的非翻译区(untranslated region,UTR)。根据cDNA序列推导的日本蟾蜍CLU前体蛋白由443个氨基酸残基组成,其中含20个氨基酸残基组成的信号肽,6个糖基化位点,10个可形成二硫键的半胱氨酸残基和2个卷曲螺旋区域。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍CLU与非洲爪蟾(Xenopus laevis)的同源性为65%,与其他7种动物的同源性则介于41%-48%之间。; 袁进强徐跃杨仙玉诸葛慧张姝芳; 关键词：聚集素基因克隆

比较中华大蟾蜍不同个体间galectin-3 cDNA分子多样性被引量：2: 2013年; 从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)某一个体的皮肤第一链cDNA中克隆到多个编码半乳糖凝聚素3(Gal-3)的cDNA。为分析该现象在中华大蟾蜍中的普遍性,分离并纯化3个不同个体的皮肤总RNA并合成其第一链cDNA,然后以此为模板,通过DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增gal-3的开放阅读框序列。序列分析结果表明,从3个不同个体中均克隆到多个不同的gal-3 cDNA的ORF,在3组不同的试验中,出现完全相同的克隆或者完全相同的缺失以及相同的多核苷酸多态性位点,支持gal-3 cDNA多样性的客观存在,揭示gal-3cDNA的多样性是该物种的特征。; 周品品万文彬袁进强潘李念徐跃杨仙玉; 关键词：中华大蟾蜍 GALECTIN-3 分子多样性

日本蟾蜍MCL-1 cDNA的克隆及生物信息学分析被引量：6: 2013年; 克隆日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1),并进行序列分析。通过菌落PCR对日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库筛选获得目的基因。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构和功能。序列分析表明mcl-1基因(GenBank登录号为JX219482)的cDNA全长为1 090 bp,5′端和3′端非翻译区域分别为19bp和432 bp,ORF由639个碱基组成,编码由212个氨基酸残基组成的蛋白质。经氨基酸序列同源性比对发现,日本蟾蜍与非洲爪蟾(Xenopus laevis)的同源性为60%,与其他7种动物的同源性在38%-55%之间。MCL-1氨基酸序列构建的进化树与传统动物分类学相符。日本蟾蜍MCL-1与人类同源蛋白具有相似的结构特征,对其cDNA序列的进一步分析,将为研究其生物学功能和药物研发奠定基础。; 张姝芳袁进强黄慧诸葛慧徐跃杨仙玉; 关键词：基因克隆

果蝇Golgin-84在发育中的表达和功能研究: 2013年; 高尔基体形态和结构的维持与真核细胞内的物质运输和细胞正常功能密切相关,高尔基体蛋白Golgin-84对维持高尔基体形态发挥了重要作用,但其在发育中的功能尚不清楚。为了研究Golgin-84在果蝇发育中的作用,成功制备并纯化了抗果蝇Golgin-84的多克隆抗体并成功构建了UAS-golgin-84-V5过表达和golgin-84 RNAi转基因果蝇,并对golgin-84在果蝇发育中的作用作了初步分析。蛋白免疫印迹和免疫荧光染色实验表明:制备的Golgin-84抗体能特异性识别重组和内源Golgin-84蛋白;Golgin-84与高尔基体蛋白GM130共定位;Golgin-84在果蝇不同发育阶段的各组织中广泛表达,在睾丸中表达较高。另外发现,选择性地在果蝇翅膀中抑制Golgin-84表达使得翅脉发育异常;过表达Golgin-84导致果蝇翅膀生长图式出现缺陷。该实验成功制备了果蝇Golgin-84抗体,获得了golgin-84转基因果蝇,并对golgin-84的功能作了初步的分析,为进一步阐明Golgin-84的作用机制奠定了基础。; 侯国丽林鑫华吴一卉刁爱坡; 关键词：黑腹果蝇抗体制备过表达

日本蟾蜍皮肤胸腺素α原cDNA的克隆及序列分析被引量：2: 2013年; 为研究蟾酥、蟾衣、蟾皮中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤cDNA质粒文库进行了筛选,获得胸腺素α原(prothymosin-α,ProTα)全长cD-NA序列,并对它们进行了生物信息学分析。日本蟾蜍ProTαcDNA全长为1 480 bp,包括339 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),5′端125 bp及3′端1 016 bp的非翻译区(untranslated region,UTR)。根据cDNA序列推导的日本蟾蜍ProTα由112个氨基酸残基组成,无信号肽结构。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍ProTα与食用蛙Rana esculenta同源性为82%,与其他11种动物的同源性则介于54%～73%。ProTα具有显著的抗肿瘤作用。分析日本蟾蜍ProTαcDNA序列,可为研究其生物学功能和药物研发提供实验依据。; 宋敏国袁进强杨仙玉张姝芳诸葛慧徐跃; 关键词：动物学基因克隆

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达被引量：1: 2013年; [目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。; 余美华张姝芳倪晓敏袁进强胡巧玲万文彬杨仙玉; 关键词：MCL-1 原核表达载体重组蛋白表达

Cloning the sterol carrier protein 2 genes of Japanese toad （Bufo japonicus formosus） and Chinese toad （Bufo gargarizans） and its tissue expression analysis被引量：1: 2014年; In this study,to clarify the bioactive polypeptides included in the skins and secretions of Bufo,we screened the Japanese toad(Bufo japonicus formosus) skin cDNA library by colony polymerase chain reaction(PCR),and obtained a transcript of 1 075 bp consisting of 1 37 bp 5′ untranslated region(UTR),515 bp 3′ UTR and a 423 bp open reading frame(ORF) encoding a polypeptide of 140 amino acid residues(GenBank accession number: KF359945).Homolog analysis showed a 70%–96% homology with sterol carrier protein-2(SCP-2) present in other animals,which is implicated in lipid metabolism of other organisms.The gene SCP-2 of Chinese toad(B.gargarizans) was cloned from a first strand cDNA of Bufo skin(GenBank accession number: KF381341) via PCR,whose encoding polypeptide has only one amino acid difference from that of Japanese toad.Tissue distribution analysis showed that SCP-2 expressed in all organs tested,though in the liver and spleen it manifested lower expression than in other organs.These findings might indicate SCP-2 being one of the active ingredients in toad skin.These findings may in turn have implications for further drug development from traditional Chinese medicine sources.; Yu-Cheng JIHui ZHUGEShan-Shan ZHANGShu-Fang ZHANGXian-Yu Yang; 关键词：CDNA克隆

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国家自然科学基金(31071181)

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