国家自然科学基金(81071770)
- 作品数：20 被引量：39H指数：4
- 相关作者：冯涛刘梦楠申利红李红丽张婷更多>>
- 相关机构：重庆医科大学重庆市生物化学与分子药理学重点实验室中国医学科学院基础医学研究所更多>>
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- 人胚胎干细胞抑制人肝癌细胞系SK-Hep1增殖并促进凋亡
- 2017年
- 目的探究在人胚胎干细胞hESCs与人肝癌细胞系SK-Hep1共培养微环境中,hESCs对SK-Hep1人肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。方法建立hESCs与SK-Hep1人肝癌细胞系的非接触式共培养体系,将与hESCs共培养的SK-Hep1细胞作为实验组,单独培养的SK-Hep1细胞作为对照组。MTT法检测SK-Hep1细胞的增殖能力;Transwell小室法检测SK-Hep1的侵袭与迁移能力;Hoechst33258染色后观察共培养后SK-Hep1细胞核的变化;流式细胞术检测SK-Hep1细胞凋亡率。结果与hESCs共培养后,SK-Hep1细胞的增殖能力受到抑制,随着时间增加,抑制效果越显著(P<0.05);细胞侵袭、迁移穿过Transwell小室的数量显著减少(P<0.05);发生核固缩、变形和浓染的SK-Hep1细胞较对照组增多;细胞凋亡比率较对照组显著增加(P<0.05)。结论人胚胎干细胞对SKHep1人肝癌细胞系有抑制作用。
- 张婷霍本念刘洁刘梦楠冯涛
- 关键词：胚胎干细胞肝癌细胞
- SNHG12在乙肝病毒X蛋白诱导肝癌发生中的作用研究
- 2023年
- 目的探究长链非编码RNA SNHG12在乙肝病毒X蛋白(HBx)诱导肝癌发生过程中的作用。方法把课题组构建的肝前体细胞14-19、EGFP-14-19、HBx-EGFP-14-19通过小鼠肝门静脉注射到体内;采用qRT-PCR、Western blot方法检测30 d,90 d,180 d,360 d小鼠肝脏组织及细胞模型中HBx、SNHG12以及下游调节基因的mRNA和蛋白表达情况;使用si-SNHG12干扰其表达,并通过CCK-8、划痕实验、transwell实验、流式细胞术观察其对体外表型影响;检测SNHG12及下游的mRNA和蛋白表达;HE染色观察小鼠肝组织切片。结果qRT-PCR结果表明SNHG12、Notch1、Hes1在HBx-EGFP-14-19细胞及各时间段的小鼠肝组织中均上调(F=48.808,P<0.0001;F=13.322,P<0.0001);Western blot结果显示在HBx过表达细胞及动物模型中,受HBx诱导SNHG12表达升高后Notch1信号通路被激活,促凋亡因子Bax下调,抗凋亡因子Bcl-2上调,细胞周期因子CDK2和Cyclin E上调;抑制SNHG12表达后,qRT-PCR、Western blot实验结果显示SNHG12(t=22.746,P<0.0001)及其上述基因表达均扭转,CCK-8实验显示细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术检测显示细胞凋亡增多,划痕及transwell实验表明细胞迁移及侵袭减弱。结论HBx通过上调SNHG12诱导Notch1表达,导致细胞增殖、周期和凋亡异常,从而促进肝癌的发生。
- 吴勇况钦周梦瑶杜彬毋楠冯涛
- 关键词：乙肝病毒X蛋白肝癌动物模型
- HBx基因通过ERK1/2信号通路促肝细胞增殖及炎性因子表达被引量：3
- 2020年
- 目的利用稳定表达HBx基因的小鼠动物模型探讨HBx基因在体内对肝脏细胞周期和肝脏炎症活动的影响。方法利用携带HBx基因的慢病毒感染肝前体细胞14-19,小鼠肝门静脉注射经改造的肝前体细胞以构建表达HBx基因的小鼠模型。利用qRT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测肝内HBx基因的mRNA和蛋白表达情况。建模后180 d检测小鼠肝组织的细胞周期调控因子CDK4和CyclinD1,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-10(IL-10)的mRNA和蛋白表达水平以及ERK1/2信号转导通路成员ERK1/2和MEK1/2的蛋白表达水平。HE染色观察HBx基因是否引起肝组织病理变化。结果稳定表达HBx基因的小鼠模型构建成功。与生理盐水组和EGFP-14-19组相比,小鼠肝脏组织在转入HBx 180d后HBx显著上调CDK4,CyclinD1,TNF-α的mRNA表达水平(P<0.01),同时显著上调CDK4,CyclinD1,TNF-α蛋白水平;HBx显著下调IL-10的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。HBx显著激活ERK1/2信号转导通路。给予ERK1/2信号通路抑制剂U0126后,与对照组相比,实验组CDK4和CyclinD1,TNF-α的mRNA表达水平显著下调(P<0.05);同时,CDK4和CyclinD1,TNF-α蛋白水平显著下调,IL-10的mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。HE染色结果显示小鼠肝脏组织在转入HBx 180d后肝脏组织明显病变。结论HBx通过激活ERK1/2信号通路促进肝细胞增殖,与肝脏炎症有关。
- 黄欣张思遥王薛杜彬毋楠周梦瑶冯涛
- 关键词：HBXERK1/2信号通路细胞周期炎症
- 胚胎干细胞对急性髓系白血病细胞KG-1a的影响被引量：2
- 2018年
- 目的:研究人胚胎干细胞H9在体外对人急性髓系白血病细胞KG-1a增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:体外将人胚胎干细胞H9和白血病细胞KG-1a进行接触式共培养,用CCK8检测KG-1a的增殖情况;用流式细胞术检测共培养后细胞的凋亡以及周期改变;荧光定量PCR检测BAX、BCL-2、caspase-3的m RNA表达;Western blot分析BAX、BCL-2、caspase-3的蛋白表达。结果:H9能明显抑制KG-1a细胞的增殖,将细胞阻滞于G2/M期,共培养后的KG-1a细胞的凋亡率高于对照组。BAX、Caspse-3的m RNA和蛋白表达均上调,BCL-2的m RNA和蛋白表达下调。结论:胚胎干细胞能抑制KG-1a细胞的增殖,促进其凋亡,其机制可能与BCL-2表达下调和BAX、Caspse-3表达上调有关。
- 刘洁刘洁张婷张婷刘梦楠王薛
- 关键词：胚胎干细胞急性髓系白血病细胞共培养
- MicroRNA-29b重组慢病毒表达载体的构建及其抑制胃癌细胞系的迁移和增殖
- 2011年
- 目的构建has-miR-29b重组慢病毒的表达载体,并观察其对胃癌细胞系迁移和增殖能力的影响。方法将PCR扩增的miR-29b前体序列和pMIR载体经双酶切后连接产生pMIR-miR-29b慢病毒表达载体。pMIR-miR-29b、Packaging Plasmid(s)和pVSV-G质粒共转染包装细胞系293TN,包装产生慢病毒。使用收获的慢病毒颗粒感染胃癌细胞系HGC-27,72 h后利用real-time PCR检测miR-29b在HGC-27内的表达水平,Western blot检测其靶基因MCL-1的表达。划痕实验和细胞增殖实验分别观察在HGC-27细胞中过表达miR-29b后细胞迁移能力及增殖能力的变化。结果成功构建了miR-29b重组慢病毒的表达载体,感染胃癌细胞HGC-27后,能够成功过表达miR-29b。在HGC-27细胞中过表达miR-29b,其靶基因MCL-1的表达明显被抑制,并且Lenti-29b组与对照组Untreat组和Lenti-vector组相比,Lenti-29b组的迁移能力显著降低(P<0.01);Lenti-29b组与Lenti-vector组相比,Lenti-29b组在48、72及96 h 3个时间点的增殖能力均显著下降(P<0.01)。结论成功获得过表达miR-29b的重组慢病毒颗粒,miR-29b能够抑制其靶基因MCL-1的表达,并对HGC-27细胞的迁移和增殖有明显的抑制作用。
- 蒋崇亮汪晓艳龚佳男王芳余佳冯涛
- 关键词：胃癌细胞慢病毒细胞迁移细胞增殖
- 乙型肝炎病毒X蛋白下调微RNA-544-3p并激活Arf6/Akt-mTOR信号轴促进肝脏细胞迁移和侵袭
- 2022年
- 目的探讨mi RNA-544-3p对乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)诱导的肝细胞癌的影响及分子机制。方法培养含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx的慢病毒稳转小鼠永生化肝前体细胞株14-19(HBx-EGFP-14-19细胞),并通过向昆明小鼠肝门静脉注射上述细胞构建可长期稳定表达HBx的模型,采用q PCR检测mi RNA-544-3p在HBxEGFP-14-19细胞及小鼠模型肝组织中的表达。在HBx-EGFP-14-19细胞中瞬时转染mi RNA-544-3p模拟物(mimic)或抑制剂(inhibitor),应用划痕愈合实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测mi RNA-544-3p对HBx-EGFP-14-19细胞迁移和侵袭的影响,采用q PCR和蛋白质印迹法探究mi RNA-544-3p对二磷酸腺苷核糖基化因子6(Arf6)、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)表达的调控作用。结果成功构建了可长期稳定表达HBx的小鼠模型,该小鼠在造模后360 d处死时可见肝组织有恶性肿瘤生成。与对照组相比,HBx-EGFP-14-19细胞和HBx模型小鼠各时间点(造模后30、90、180、360 d)肝组织中mi RNA-544-3p表达水平均降低(P均<0.05)。与对照组比较,转染mi RNA-544-3p mimic的HBx-EGFP-14-19细胞迁移和侵袭能力均降低,转染mi RNA-544-3p inhibitor的HBxEGFP-14-19细胞迁移和侵袭能力均增强(P均<0.05)。q PCR和蛋白质印迹法检测结果显示mi RNA-544-3p低表达与Arf6表达水平上调、Akt-m TOR信号轴的激活有关。结论HBx可能通过下调mi RNA-544-3p激活Arf6/AktmTOR信号轴促进小鼠肝癌细胞的侵袭和迁移能力。
- 况钦吴勇杜彬毋楠周梦瑶杨鑫卢杨冯涛
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白蛋白激酶B哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
- MicroRNA-144调控红系分化被引量：1
- 2011年
- 目的研究microRNA-144(miR-144)通过调节视网膜母细胞瘤蛋白(RB)对红系分化的影响。方法用氯化高铁血红素(hemin)诱导人慢性髓系白血病细胞系K562可实现在体外模拟红系分化过程,使用Real-time PCR检测miR-144表达;利用体外合成的寡核苷酸(mimic-144)转染K562细胞,检测过量表达miR-144对红系分化的影响;结合生物信息学分析、双荧光素酶报告系统和Western blot寻找并确定miR-144的靶基因。结果 miR-144在hemin诱导的K562红系分化过程中表达显著升高(P<0.05),在K562细胞中过表达miR-144可以促进血红蛋白(γ-globin)和红细胞表面标志CD235a的表达和积累;RB为miR-144的靶基因之一;在K562红系分化中,RB呈先略升后降的趋势,以0 h为参照,12 h RB/GAPDH灰度值最低为:0.092±0.007(P<0.05)。结论 miR-144通过负调控RB的表达促进hemin诱导的K562红系分化。
- 汪晓艳蒋崇亮朱勇王芳余佳冯涛
- 关键词：红系分化视网膜母细胞瘤蛋白
- 人胚胎干细胞对肝癌HepG2细胞体外抑制作用的研究
- 2017年
- 目的:研究体外共培养情况下人胚胎干细胞H9对肝癌HepG2细胞的抑制作用。方法:建立人胚胎干细胞(H9)与肝癌HepG2细胞共培养体系,显微镜下观察胚胎干细胞对肿瘤细胞生物学行为的影响,流式细胞仪检测H9细胞对肿瘤细胞的凋亡与周期的影响,Transwell小室法检测H9细胞对HepG2细胞侵袭和迁移的影响,基因芯片分析共培养后HepG2细胞全基因组的表达谱变化。结果:结果发现共培养过程中,肝癌HepG2细胞生长受到抑制,随共培养时间延长,细胞数量逐渐减少,出现老化或凋亡迹象;流式细胞术检测发现HepG2细胞凋亡率显著增加,细胞周期被阻滞于G0/G1期;Transwell实验发现HepG2细胞侵袭、迁移力均降低;基因芯片结果发现HepG2细胞全基因组表达谱发生了显著变化,差异基因涉及多条信号通路。结论:人胚胎干细胞H9体外对人肝癌细胞HepG2有一定程度的抑制作用。
- 郑良栋何雪梅张婷刘洁霍本念刘梦楠王薛冯涛
- 关键词：胚胎干细胞肝癌共培养
- 低浓度血清促进胚胎肝祖细胞诱导分化
- 2018年
- 为了探讨不同血清浓度诱导培养条件下对体外诱导胚胎肝祖细胞成熟分化的影响。本研究选用含有10%FBS、5%FBS、2%FBS的DMEM/HGF/FGF4肝细胞培养基体外诱导胚胎肝祖细胞的成熟分化,分别于诱导后0d、3d、6d、9d、12dALB-GLuc检测细胞白蛋白的合成水平,细胞计数检测细胞的成长曲线。RT-PCR检测肝细胞相关标志DLK、AFP、CK18,免疫荧光检测ALB、UGT1A的表达情况。ICG摄取和尿素氮检测肝细胞成熟功能。诱导后第三天,ALB-GLuc开始增高,于第9天达高峰,2%FBS组ALB-GLuc读数最高。生长曲线显示低血清浓度下细胞的增殖速度明显慢于高血清浓度。RT-PCR和免疫荧光结果显示诱导后第9天,3个诱导组DLK、AFP表达低于无诱导组,CK18、ALB、UGT1A均高于无诱导组,2%FBS组差异最显著。3个诱导组的肝细胞ICG摄取能力明显增高,2%FBS组ICG阳性细胞数为（60.2±9.0）%,明显高于5%FBS（45.0±3.6）%及10%FBS组（35.2±2.9）%,诱导后肝细胞的尿素合成功能增强,尤其是2%FBS组。低浓度血清培养条件能更好的诱导胚胎肝祖细胞的体外成熟分化。
- 张维玉辜钦娅曾德峰
- 关键词：血清浓度诱导分化
- HBx通过Notch信号通路在正常免疫小鼠体内导致肝癌的作用机制被引量：5
- 2021年
- 目的构建长期携带乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBx)的正常免疫小鼠模型,以探讨HBx在体内导致肝癌发生的机制。方法将转染HBx的肝前体细胞经肝门静脉注射入昆明小鼠体内构建动物模型,分别于术后30、90、180、360 d收取肝脏组织,Western blot和RT-qPCR检测HBx的表达,HE染色观察组织病理切片,Western blot和RT-qPCR检测Notch1、Notch4、Hes1的表达,然后于180 d腹腔注射抑制剂DAPT,Western blot和RT-qPCR检测肝脏细胞凋亡及细胞周期相关因子的表达变化。结果动物模型构建成功且于360 d发生肝癌,与对照组相比,Notch1、Notch4、Hes1的基因及蛋白水平均于30 d呈现显著上调且一直持续至360 d(P<0.05、P<0.05、P<0.001;P<0.05、P<0.05、P<0.01);Bcl-2、CDK4、CyclinE、CyclinD1的蛋白水平在HBx组上调(P<0.001;P<0.01;P<0.001;P<0.01),Bax呈下调(P<0.001),基因水平与其一致(P<0.05;P<0.001;P<0.001;P<0.01;P<0.001),而抑制剂DAPT组显著扭转上述趋势。结论HBx在体内通过持续激活Notch通路引起细胞凋亡及细胞周期异常变化,最终导致肝癌发生。
- 周梦瑶杜彬毋楠黄欣张思遥况钦吴勇冯涛
- 关键词：乙型肝炎病毒X小鼠模型NOTCH信号通路DAPT
