国家重点基础研究发展计划(2011CB910701)
- 作品数：5 被引量：2H指数：1
- 相关作者：高学娟刘朗夏刘小会汪洋余汝媛更多>>
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- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家教育部博士点基金国家自然科学基金更多>>
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- 小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析被引量：1
- 2012年
- 目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。
- 王通郭嘉慧陈智鹏银兴峰马文心崔毅峙
- 关键词：SILAC质谱蛋白质组
- PCNA蛋白突变体的真核表达载体构建及鉴定
- 2012年
- 目的构建带FLAG标签的细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白Y211A、Y211D突变型重组质粒,真核表达及鉴定。方法以FLAG-PCNA野生型基因为模板,运用PCR定点突变技术扩增出带突变位点的基因序列,将其插入真核表达载体pCMV-N-FLAG,进行双酶切实验和测序验证。然后,利用脂质体将重组质粒转染至293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果 FLAG-PCNA(Y211A)、FLAG-PCNA(Y211D)重组质粒测序结果正确,获得PCNA蛋白突变体。结论成功构建了带FLAG标签的PCNA蛋白Y211A、Y211D真核表达载体,验证了突变型PCNA融合蛋白的表达,为PCNA蛋白功能的深入研究奠定了基础。
- 刘小会淡松松秦焕焕高学娟刘朗夏
- 关键词：PCNA蛋白突变体真核表达
- 脂多糖持续刺激巨噬细胞的免疫学机制初探被引量：1
- 2015年
- 目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)的持续刺激下产生免疫抑制后的表型变化及对T细胞影响的分子机制。方法:蔗糖密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞,结合磁珠细胞分选技术分选出单核细胞,体外诱导单核细胞分化为巨噬细胞,以未处理和IFN-γ处理为对照,对LPS处理48 h的巨噬细胞进行形态学观察、细胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表达的检测和细胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的检测。同时将LPS诱导的巨噬细胞与CD3+T细胞进行异体共培养,进一步观察巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响。用实时荧光定量PCR验证Toll样受体4(TLR4)信号通路中的非My D88依赖型途径相关分子的表达水平。结果:LPS处理48 h的巨噬细胞,抗原递呈能力(HLA-DR)下降,免疫抑制细胞因子IL-10升高,把LPS诱导的巨噬细胞与异体T细胞共培养6 d,其促进CD8+T细胞增殖的能力较弱。实时荧光定量PCR结果显示LPS持续刺激下巨噬细胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下调状态。结论:持续LPS处理巨噬细胞48 h后,巨噬细胞呈现一种免疫抑制的状态,且其刺激CD8+T细胞增殖的能力减弱,这种状态与非My D88依赖型TLR4信号通路受损有关。
- 龙允麟陈颖余汝媛汪洋
- 关键词：巨噬细胞脂多糖TOLL样受体4
- Raf-1蛋白突变体的原核表达、纯化及活性鉴定
- 2012年
- 目的:将Raf-1蛋白259位丝氨酸(Ser,S)突变成天冬氨酸(Asp,D),构建突变型GST-Raf-1220-268S259D原核表达载体,表达和纯化融合蛋白及鉴定其生物学活性。方法:以pGEX-4T-1-Raf-1220-268为模板,运用PCR定点突变技术扩增出Raf-1220-268S259D基因序列,插入原核表达载体pGEX-6P-1,表达和纯化重组蛋白,GST沉降实验鉴定蛋白的生物学活性。结果:重组质粒测序结果正确,获得模拟磷酸化GST-Raf-1220-268蛋白。GST沉降实验检测到目的蛋白和14-3-3蛋白具有体外特异性结合活性。结论:成功构建GST-Raf-1220-268S259D原核表达载体,并表达及纯化了有生物学活性的融合蛋白,为进一步针对Raf-1的研究提供实验依据。
- 刘小会高学娟刘朗夏
- 关键词：突变体原核表达纯化
- 埃兹蛋白(Ezrin)及其突变体的原核表达与纯化
- 2012年
- Thr567位点磷酸化是ezrin活化的必需条件。利用定点突变引物将T567突变为A或D,通过PCR扩增出相应的基因片段,将其通过T4连接酶连接至含His标签的原核表达载体pET-20b(+),构建了原核重组质粒pET-20b(+)-Ez WT,pET-20b(+)-EzT567A和pET-20b(+)-EzT567D。转化表达宿主大肠杆菌Rosseta后,用异丙基-β-硫代半乳糖诱导重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和镍柱纯化以后,应用western blot鉴定纯化的融合蛋白。Ezrin野生型及其组成型激活和显性负突变质粒的成功构建及其目的蛋白His-Ez WT,His-EzT576A和His-EzT576D的成功表达纯化,为更深入地研究ezrin生物学功能奠定基础。
- 刘腾飞陈妙娟高学娟刘小会刘朗夏
- 关键词：埃兹蛋白野生型
