湖北省教育厅重点项目(D200624006)
- 作品数：10 被引量：42H指数：5
- 相关作者：郎明健杨汉东闵新文郭敏曾秋棠更多>>
- 相关机构：华中科技大学郧阳医学院附属东风医院湖北医药学院更多>>
- 发文基金：湖北省教育厅重点项目湖北省自然科学基金更多>>
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- 大鼠结缔组织生长因子短发夹RNA干扰质粒重组体的构建和鉴定被引量：9
- 2007年
- 目的构建靶向大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行抗心肌纤维化的研究做准备。方法根据大鼠CTGFmRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同。结论成功构建靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体,为质粒的筛选和进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础。
- 郎明健曾秋棠郭敏杨汉东闵新文
- 关键词：结缔组织生长因子RNA干扰心肌纤维化质粒
- 吡格列酮预处理对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体ATP敏感性钾通道的影响
- 2007年
- 目的:观察吡格列酮(Pio)对在体大鼠心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体ATP敏感性钾通道影响,探讨Pio对心肌缺血损伤保护作用及其机制.方法:24只SD大鼠随机分为假手术组(SO组),缺血/再灌注组(I/R组),Pio预处理组(Pio组)和线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂5-羟基葵酸(5-HD)+Pio组(5-HD+Pio组)4组.各组于缺血/再灌注前24h尾静脉注射相应溶媒及药物,5-HD+Pio组注入5-HD10mg/kg30min后再给予Pio3mg/kg;Pio组只注入Pio3mg/kg;SO组不结扎前降支,4h后取出心脏;余三组结扎前降支30min,再灌注4h后取出心脏.用透射电镜观察心肌线粒体超微结构的改变;采用TUNEL法和免疫组化法检测缺血心肌细胞凋亡和Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白的表达以及RT-PCR法测FasmRNA的表达.又另取18只SD大鼠随机分成SO,I/R和Pio组,行心肌梗死范围的测定.结果:①与I/R组相比,Pio组线粒体损伤程度明显减轻;②与I/R组(34.93±5.55)%相比,Pio组(20.24±3.93)%心肌梗死范围明显减少(P<0.05);③与I/R组相比,Pio组能明显增加Bcl-2蛋白的阳性细胞指数(P<0.05),降低心肌细胞凋亡率(P<0.05)及Bax,Caspase-3蛋白的阳性细胞指数(P<0.05),下调FasmRNA的表达水平.I/R组与5-HD+Pio组相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论:Pio预处理可通过保护心肌线粒体结构,减少心肌细胞凋亡及梗死范围,保护缺血心肌损伤作用可被线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂所对抗.
- 李健冯义柏田莉郎明健杨汉东
- 关键词：吡格列酮缺血再灌注钾通道
- 靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的构建和作用分析被引量：5
- 2008年
- 目的:构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的shRNA表达载体.方法:根据大鼠CTGF mRNA序列设计并构建4个靶向大鼠CTGF基因的shRNA干扰质粒;然后以脂质体转染试剂将目的质粒转染至大鼠心肌成纤维细胞,流式细胞技术分选出成功转染的阳性细胞.通过RT-PCR和Western Blot技术对成功构建的4个shRNA干扰质粒进行有效性筛选,分析其CTGF mRNA及蛋白表达水平.结果:酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入载体,经测序证明与设计的相同;在转染成纤维细胞48h后,与空白对照组比较,有3组细胞CTGF mRNA及蛋白表达水平明显降低;而转染非特异阴性质粒对照组CTGF mRNA及蛋白表达水平无明显变化.结论:成功构建并筛选出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体,为进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础.
- 郎明健曾秋棠郭敏杨汉东闵新文
- 关键词：结缔组织生长因子RNA干扰心内膜心肌纤维化
- 结缔组织生长因子在心血管疾病的作用及研究进展被引量：6
- 2011年
- 结缔组织生长因子是一种新发现的可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子,结缔组织生长因子具有广泛的生物学功能如促纤维化、促有丝分裂、趋化作用、促细胞增殖,诱导凋亡以及促血管新生等。结缔组织生长因子在多种细胞均可表达,在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化病变,心肌梗死以及心肌炎等各种心血管疾病中结缔组织生长因子表达均明显增高,并可能通过其多种生物学行为参与心血管重塑、心脏纤维化和动脉粥样硬化病变的发生发展。
- 郎明健赵黎丙何培根闵新文杨汉东
- 关键词：结缔组织生长因子心血管疾病
- RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子对心肌纤维化的影响被引量：2
- 2009年
- 背景心肌纤维化是心脏重塑的重要特征,结缔组织生长因子具有刺激成纤维细胞增殖及促进细胞外基质合成的生物学功能,是一种重要的促纤维化细胞因子,然而其对心肌纤维化的作用还没有得以系统研究。目的研究RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子(CTGF)对自发性高血压大鼠心肌组织纤维化指标的影响。方法20只自发性高血压大鼠随机分为未干预的SHR组和CTGF RNA干扰(RNAi)组,并设置WKY组大鼠为正常对照。在RNA干扰结束后,处死大鼠获取血液和心脏标本,计算左室质量/体质量(LVM/BM),ELISA法检测血浆纤维连接蛋白(FN)和层黏蛋白(LN)浓度;逆转录PCR和Western blot检测心肌组织CTGF及FN的mRNA和蛋白表达,免疫组化技术分析CTGF及FN的表达。天狼星红染色及羟脯氨酸测定分析心肌组织胶原类型及代谢水平。结果RNA干扰组血压水平和LVM/BM较SHR组无明显差异(P>0.05),RNA干扰使CTGF和FN mRNA表达分别下调60%和54%(P<0.01),蛋白表达分别下调30%和44%(P<0.01);免疫组化显示了同样的抑制效应,CTGF主要存在于心肌细胞,而FN主要在心肌间质表达。天狼星红染色显示RNA干扰组胶原沉积减少,偏光显微镜下观察到RNA干扰主要抑制了Ⅰ型胶原的合成;心肌组织羟脯氨酸含量和心肌组织胶原容积分数(CVF)在RNA干扰组分别显著减少36%和30%(P<0.01)。结论靶向抑制CTGF可以显著抑制细胞外基质在心肌间质的沉积,CTGF靶向性RNA干扰的抗心肌纤维化效应与降压无关。
- 郎明健闵新文杨汉东郭敏曾秋棠
- 关键词：结缔组织生长因子心肌纤维化RNA干扰细胞外基质
- RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子拮抗肾脏纤维化的发展被引量：5
- 2010年
- 目的 研究RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子（CTGF）对高血压大鼠肾脏纤维化指标的影响.方法 本研究于2006-2008年在武汉协和医院心血管病研究所完成,实验以自发性高血压大鼠（SHR）为动物模型,随机（随机数字法）分为未干预的SHR组（n=10）和RNA干扰组（RNAi组,n=10）,并设置WKY大鼠（n=8）为正常对照组.构建并筛选出靶向大鼠CTGF的RNAi质粒重组体,通过升主动脉钳夹冠脉灌注法联合尾静脉注射将质粒转染至大鼠体内,RNA干扰结束后,获取肾脏标本,RT-PCR和Western blotting检测肾脏组织CTGF及纤维连接蛋白（FN）的mRNA和蛋白表达,免疫组化技术分析CTGF及FN在肾脏的空间表达.0.1%天狼星红-饱和苦味酸胶原染色分析肾组织胶原类型及代谢水平（以胶原容积分数CVF表示）,比色法测定肾脏组织羟脯氨酸含量.所有数据以（x-±s）表示,多个均数的组间比较采用单因素方差分析,以P〈0.05为有统计学意义.结果 RNA干扰使高血压大鼠肾脏组织CTGF的mRNA和蛋白表达分别下调66%和62%（P〈0.01）,FN mRNA和蛋白的表达也相应降低达56%和51%（P〈0.01）;免疫组化显示了同样的抑制效应,而且观察到CTGF及FN不同的空间表达,CTGF在肾实质和间质中均可表达,而FN主要在肾脏间质表达.天狼星红染色显示RNA干扰组胶原沉积减少,偏光显微镜下进一步观察到RNA 干扰主要抑制了I型胶原的合成;肾脏组织羟脯氨酸含量在RNA干扰组显著减少[SHR组：（0.596±0.067）μg/mg,RNAi组：（0.368±0.084）μg/mg,P〈0.01].结论 C-CTGF靶向性RNA干扰显著下调肾组织中CTGF的表达并相应抑制细胞外基质在肾间质的沉积,且这种效应独立于降压之外.提示CTGF在肾脏纤维化发生及进展中起着关键作用.
- 郎明健闵新文李健郭敏杨汉东
- 关键词：结缔组织生长因子肾脏纤维化RNA干扰纤维连接蛋白
- RNA干扰选择性下调心肌成纤维细胞结缔组织生长因子被引量：1
- 2008年
- 目的研究RNA干扰技术能否选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)及其诱导的下游纤维化成分的表达。方法利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞。用携带U6启动子和CTGF特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体CTGF-shRNA,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒CTGF-con以lipofectamine ^(TM)2000为载体转染原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞。加入含G418的DMEM培养液培养一月筛选后获得稳定转染的细胞。通过半定量RT-PCR检测细胞内转化生长因子(TGF-β_1),CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达,Western-blot法检测细胞内CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达。结果CTGF在心肌成纤维细胞中有基础表达,并在转化生长因子β_1(TGF-β_1)刺激下其含量增加,CTGF-shRNA使心肌成纤维细胞CTGF的mRNA和蛋白质的表达分别降低65%和78%,FN的mRNA和蛋白质的表达分别降低81%和63%,而TGF-β_1 mRNA的表达上调32%。转染对照质粒组较空白对照组与脂质体组CTGF,FN表达量差异无统计学意义。结论RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞CTGF及下游纤维化成分FN的表达,进一步为拮抗心肌纤维化的基因治疗提供了依据。
- 郭敏郎明健曾秋棠杨汉东闵新文
- 关键词：RNA干扰结缔组织生长因子转染心肌成纤维细胞心肌纤维化
- 质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性被引量：4
- 2008年
- 目的:探讨应用阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性.方法:构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒.将22只雄性SD大鼠随机分为4组:阴性对照组(Ⅰ组,n=4),心肌注射组(Ⅱ组,n=6),尾静脉注射组(Ⅲ组,n=6)和冠状动脉灌注组(Ⅳ组,n=6).分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染.Ⅱ～Ⅳ组于转染后2,14d时间点各随机处死3只大鼠,阴性对照组各处死2只大鼠,取心肌组织作快速冰冻切片,荧光显微镜下观察EGFP表达情况.结果:在荧光显微镜下观察EGFP表达情况,阴性对照组隐约可见淡绿色荧光,第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织.各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(P<0.05).心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义(P=0.17).冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7.37倍(P=0.013).第2周转染各组荧光强度明显减弱,与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.41).结论:阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织,而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率.
- 郭敏郎明健曾秋棠杨汉东闵新文
- 关键词：心肌转染质粒绿色荧光蛋白质类
- RNA干扰选择性下调血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的表达被引量：4
- 2007年
- 目的:从血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的基础分泌及转化生长因子β1对其分泌的诱导作用入手,进一步观察并验证RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子对下游纤维化因子的影响。方法:实验于2006-03/2007-05在武汉协和医院心血管病研究所实验室完成。①实验材料:健康雄性成年SD大鼠,体质量150～180g。②实验方法及分组:分离培养成年大鼠血管平滑肌细胞,以5μg/L终浓度转化生长因子β1对培养的血管平滑肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠结缔组织生长因子的shRNA干扰质粒转染入血管平滑肌细胞,200mg/L终浓度的G418筛选出稳定转染细胞株后培养增殖进入后续实验。将实验分为5组,分别为对照组,不给与任何干预措施;转化生长因子β1刺激组,在培养的血管平滑肌细胞培养液中加入转化生长因子β1(5μg/L终浓度)刺激诱导24h;HK阴性质粒对照组,血管平滑肌细胞常规培养3～5代后转染HK阴性质粒继续培养48h;RNA干扰组,先以转化生长因子β1(5μg/L终浓度)诱导刺激血管平滑肌细胞24h后再转染干扰质粒继续培养48h;单纯转染试剂组,细胞常规培养3～5代后仅加入lipo2000转染试剂。③实验评估:通过逆转录-聚合酶链反应和(或)蛋白免疫印迹技术进一步检测各组心肌细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达。结果:①组织块贴附法培养的原代血管平滑肌细胞,可见大量细胞紧密排列成长梭形。②倒置荧光显微镜下观察,脂质体lipo2000转染血管平滑肌细胞瞬时转染效率仅有大约30%左右;而通过加入G418进行稳定转染后,几乎所有细胞均可被激发出亮绿色荧光,转染效率可达95%以上。③对照组结缔组织生长因子、纤维连接蛋白均有低水平的基础分泌,在予以转化生长因子β1诱导后表达显著升高(P<0.01);而在靶向特异性RNA干扰后,与转化生长因子β1刺激组比较,结缔组�
- 闵新文郎明健杨汉东郭敏李健
- 关键词：血管平滑肌细胞结缔组织生长因子RNA干扰纤维化
- 差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响被引量：9
- 2008年
- 目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞，分别进行1—3次差速贴壁并联用或不联用5-BrdU以纯化心肌细胞。正常培养3d后，观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加，心肌细胞得以纯化，但细胞的活性有所下降。联用5-BrdU后细胞纯度进一步提高，且对细胞的活性无明显影响；其中两次差速贴壁并联合应用5-BrdU后，可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-BrdU为纯化心肌细胞的有效方法。
- 郎明健郭敏曾秋棠闵新文杨汉东
- 关键词：心肌细胞纯化
