国家高技术研究发展计划(2006AA02A237)
- 作品数：15 被引量：26H指数：3
- 相关作者：李震中白欣立魏玉英杨琨邢丛丛更多>>
- 相关机构：河北医科大学第二医院第四军医大学北京协和医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定。方法通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM(-TEasy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA。将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank中的PSCA序列一致。pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD。结论成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础。
- 任杰高江平阎瑾琦江乐于继云
- 关键词：质粒重组融合蛋白质类
- 吉兰-巴雷综合征相关空肠弯曲菌cstⅡ基因序列对比研究被引量：1
- 2011年
- 目的研究华北地区3株吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）相关空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）的cstⅡ基因序列并寻找GBS相关及GBS无关的两类空肠弯曲菌菌株间可能与GBS致病性相关的基因突变位点和蛋白高级结构变化，分析菌株间遗传进化关系。方法选取分离自GBS患者粪便并经动物模型证实为致GBS的3株空肠弯曲菌菌株进行培养并提取基因组DNA测序，与GenBank中GBS无关空肠弯曲菌基因序列进行配对对比，寻找两类菌株间可能导致空肠弯曲菌致病能力差异的cstⅡ基因碱基突变位点及蛋白高级结构改变，观察这种变化是否为GBS相关菌株的共性，并构建遗传进化树。结果与GBS无关菌株相比，3株致GBS菌株cstⅡ基因的氨基酸序列二级结构的第7个0L螺旋的165—180区段均被打开形成了折叠或转角，该变化在其他GBS相关菌株的二级结构变化中同样得到体现。实验中75％的GBS相关菌株cstⅡ基因为双功能，25％GBS相关菌株及所有GBS无关菌株cstⅡ基因为单功能。LL株与实验中涉及的GBS相关菌株在进化上高度类聚。结论双功能cstⅡ可能与空肠弯曲菌的致GBS特性相关。LL株cstⅡ基因在一定程度上反映了亚洲地区的GBS相关菌株cstⅡ基因的序列特征，为进一步探索GBS发病的地域性特点并对GBS菌株进行监测提供了资料。
- 孙世超白欣立陈娟王莹邢丛丛付金生李震中
- 关键词：吉兰-巴雷综合征空肠弯曲菌
- 重组肿瘤相关抗原蛋白与肿瘤治疗性DNA疫苗静电耦合成为复合纳米颗粒的初步研究被引量：2
- 2008年
- 目的:验证原核表达的重组肿瘤相关抗原蛋白SUR-IM与肿瘤治疗性DNA疫苗pVAX1-2PFcGB能够通过静电耦合形成复合纳米颗粒。方法:通过蛋白-DNA琼脂糖凝胶电泳阻滞实验、DNaseⅠ消化核酸的保护实验及原子力显微镜观察验证二者是否结合;此外,通过体外瞬时转染293T细胞研究蛋白质所结合的质粒是否能够在体外顺利表达。结果:证实二者确实能够通过静电耦合形成纳米级的颗粒,结合后蛋白质对DNA具有一定的保护作用,并且蛋白不会影响与之结合的质粒在细胞中的高效表达。结论:该复合纳米颗粒将蛋白质和核酸组分有机结合在一起,使肿瘤抗原、免疫佐剂及DNA肿瘤疫苗协同发挥作用,为日后进行抗肿瘤功能研究奠定了重要基础。
- 王浩阎瑾琦张飒贾锐张亮刘宁王宇宋晓国于继云
- 关键词：重组蛋白
- 截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定
- 2011年
- 目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。
- 李海涛宋朝君孙元杰魏玉英李永明刘飞刘志佳张葵金伯泉杨琨
- 关键词：GST融合蛋白蛋白表达
- CIITA对MHC-Ⅱ基因的表达调控及其应用被引量：2
- 2008年
- MHC-Ⅱ在适应性免疫应答及T细胞的选择活化过程中具有重要作用。MHC-Ⅱ反式激活蛋白(CⅡTA)是调控其表达的关键分子。CⅡTA可协调多种转录因子与MHC-Ⅱ基因启动子作用,调控过程中还涉及到表观遗传学修饰及染色质重组,这些研究在基因疫苗设计、肿瘤治疗等方面都有着积极的意义。
- 魏玉英杨琨
- 关键词：CIITA表观遗传学疫苗
- 以肿瘤抗原BAP31为靶点的基因疫苗构建及其诱导小鼠免疫反应的研究被引量：3
- 2009年
- 目的:构建重组表达载体P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗并接种小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法:利用分子克隆技术,构建重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31,同时构建P-BAP31/EGFP和P-L-BAP31/EGFP重组质粒,并将其以脂质体瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31免疫C57BL/6小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测免疫脾细胞在受到BAP31抗原刺激后产生IFN-γ和IL-4细胞因子的频率;通过乳酸脱氢酶(LDH释放)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答。结果:酶切及测序结果表明,成功构建了针对BAP31肿瘤抗原的P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗。通过荧光显微镜观察重组质粒转染的HeLa细胞,可见EGFP报告基因表达的绿色荧光。ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价发现,带LAMP组明显高于不带LAMP组(P<0.05),且两者均高于空质粒(P-LAMP)及正常对照(N)组(P<0.01)。ELISPOT检测脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率,带LAMP组与其他组相比显著提高(P<0.01)。LDH释放试验显示,带LAMP组的特异性CTL活性高于不带LAMP组,且均高于对照组(P<0.01)。结论:构建了针对肿瘤抗原BAP31的全长基因疫苗,以其免疫C57BL/6小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫反应,其中,P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31。
- 宋朝君孙元杰魏玉英张赟欧阳清陈琨金伯泉杨琨
- 关键词：基因疫苗ELISPOT
- 吉兰-巴雷综合征空肠弯曲菌感染诱导巴马小型猪致周围神经病动物模型的建立被引量：3
- 2012年
- 目的使用致吉兰-巴雷综合征的空肠弯曲菌活菌诱导的巴马小型猪建立周围神经病动物模型。方法使用吉兰-巴雷综合征病人粪便中分离的空肠弯曲菌,微需氧培养后口服攻毒30只巴马小型猪,建立周围神经病动物模型。结果实验组在攻毒后14～16天出现临床症状,两周内解剖。临床症状周围神经病重症的占40.9%(9/22),出现周围神经病症状的占81.8%(18/22)。病理学检查锇酸染色可见卵圆体结构,镀银坚固蓝染色见轴索断裂,未见脱髓鞘。结论本实验通过致吉兰-巴雷综合征的空肠弯曲菌活菌构建了巴马小型猪周围神经病动物模型,模拟了自然条件下侵染致病的过程,为研究周围神经病的发病机理提供了大型动物模型。
- 徐飞邢丛丛陈扬李震中白欣立
- 关键词：吉兰-巴雷综合征动物模型空肠弯曲菌巴马小型猪
- 吉兰-巴雷综合征相关空肠弯曲菌waaF基因序列对比研究被引量：1
- 2011年
- 目的了解吉兰-巴雷综合征(GBS)相关空肠弯曲菌(C.jejuni)waaF基因核酸及氨基酸序列特征,分析其遗传进化关系。方法选取3株致GBS C.jejuni菌株,提取其基因组测序。应用生物信息学软件,以NCTC11168序列为参照进行比对,分析waaF基因碱基及相应氨基酸突变、二级结构变化,计算遗传距离。结果 3株致GBS C.jejuni waaF基因均由960个碱基构成,相同碱基突变位点有5个,1081462位zhanxingT→A,lulei、qiaoyuntaoT→G导致相同氨基酸改变:185位D→E,该位点导致α螺旋结构的改变。3株致GBS C.jejuni waaF基因遗传距离较小。结论 GBS相关C.jejuni菌株waaF基因序列存在相同碱基及氨基酸突变及二级结构变化,这可能与C.jejuni致GBS能力的改变相关。河北地区致GBS的C.jejuni在进化上存在聚类现象。
- 陈娟李震中白欣立刘慧李鑫赵子春刘卫卫郭医杰邢丛丛李春岩
- 关键词：吉兰-巴雷综合征空肠弯曲菌
- 格林-巴利综合征相关空肠弯曲菌galE基因序列对比研究被引量：2
- 2009年
- 目的测定3株格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）相关空肠弯曲菌的galE基因序列，并同GenBank中的空肠弯曲菌菌株相应序列进行比较，了解致GBS的序列特征并分析其遗传进化关系。方法选取分离自GBS患者粪便并经动物模型证实为致GBS的3株AMAN型空肠弯曲菌菌株进行培养并提取基因组DNA测序。将基因测序结果通过与NCTC11168菌株进行对照比较寻找galE基因突变位点并对galE基因片段进行遗传距离计算。结果3株致GBS空肠弯曲菌菌株的galE基因均由987个碱基构成。与NCTC11168的galE基因序列相比，此3株空肠弯曲菌菌株gale基因核苷酸序列有4个相同碱基突变并导致了4个对应的相同氨基酸突变。遗传距离计算，zhanxing株与qiaoyuntao株距离为1．5％，zhanxing株与lulei株距离为1．6％，qiaoyuntao株与lulei株距离为0．5％。结论GBS相关空肠弯曲菌中galE基因核苷酸序列的确存在相同变异且发生变异概率较非GBS相关空肠弯曲菌明显增大，遗传距离反映了此3株致GBS的空肠弯曲菌具有一定的区域特征。
- 李鑫李震中白欣立刘慧赵子春刘卫卫方保峰王红郭医杰李春岩
- 关键词：格林-巴利综合征空肠弯曲菌
- Comparative gene sequence of wla gene cluster in Campylobacter jejuni strains causing Guillain-Barré Syndrome
- Objective To investigate the campylobacter jejuni risk factor for development of Guillain-Barré Syndrome,the w...
- 刘慧
- 文献传递
