国家自然科学基金(31160510)
- 作品数：15 被引量：26H指数：3
- 相关作者：吴润万学瑞刘磊杨润霞张小丽更多>>
- 相关机构：甘肃农业大学中国农业科学院兰州兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金甘肃省自然科学基金家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 朊蛋白生理功能研究进展被引量：3
- 2012年
- 朊蛋白作为一种高度保守的细胞膜糖蛋白,广泛分布于机体各组织器官,参与信号跨膜传导、细胞黏附、铜离子代谢、抗细胞凋亡、抗氧化应激等过程。近年来,随着对朊蛋白结构、生理功能、变构机制等的深入研究,对它的认识已不再局限于一种单纯的致病因子,朊蛋白在遗传进化、生理功能上所表现出的重要作用已成为新的研究热点。我们首先分析了朊蛋白的细胞定位、转运及组织分布,其次对朊蛋白在神经系统、肿瘤发生、胚胎发育过程中发挥的生理功能做简要介绍,最后对该蛋白的研究前景进行了展望。
- 刁小龙吴润
- 关键词：朊蛋白生理功能
- 武威驴PrP基因序列与结构特征的分析
- 2015年
- 以武威驴朊蛋白(PrP)基因序列与结构特征分析为基础,通过比对找到奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因的差异,探究朊病毒病在奇蹄动物与偶蹄动物之间传播的种间屏障及其形成机制。分别从8头武威驴全血中提取基因组总DNA,用设计的特异性引物以聚合酶链反应扩增出细胞型朊蛋白基因(PrPC),并将其克隆到pGEM-T Easy载体。测序之后使用生物信息学方法与软件进行相关分析。序列测定分析表明,所克隆的武威驴PrP基因片段的大小为768bp,包含了驴PrP基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框。本次克隆的武威驴PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码九肽/八肽PQGGGGWGQ/PHGGGWGQ重复子。8个驴PrP基因之间核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别介于99.2%~99.8%和98.4%~100%之间。武威驴与西吉驴、马之间PrP基因序列的同源性分别为99.2%和98.7%,与牛、绵羊、马之间PrP基因C端约100个残基区域的三级结构的相似性分别为91.84%、92.04%和97.35%。结果表明,奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因存在明显的差异与进化分歧。
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
- 关键词：偶蹄动物
- 鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达被引量：1
- 2015年
- 为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白（ChPrP）,根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G＋C含量等特点对目的基因PrP（25～248）进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP（25～248）,并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
- 关键词：PPIC9K毕赤酵母GS115真核表达
- PI3K/Akt抑制剂对鸡朊蛋白过表达DF-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响被引量：2
- 2015年
- 为探讨PI3K/Akt信号通路在鸡细胞型朊蛋白(ChPrPC)过表达的DF-1细胞(DF-1-PrP)增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrPC表达量的关系,以DF-1-PrP细胞为模型,空载体转染的DF-1-NC细胞和DF-1细胞为对照,分别用0、10、20、50、100、200nmol·L-1渥曼青霉素处理以抑制PI3K/Akt信号通路,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因转录量。结果显示,随着渥曼青霉素浓度的增加,DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞的PRNP基因转录量均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在低于100nmol·L-1的同一渥曼青霉素浓度下,DF-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于对照组,而总凋亡率均低于对照组。本研究表明ChPrPC的过量表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,在以上过程中,PI3K/Akt信号通路可能具有重要的作用,渥曼青霉素能有效阻断这一通路,但PI3K/Akt信号通路并不是ChPrPC调节细胞凋亡的唯一途径。
- 万学瑞朱曼玲杨润霞刘桂林刘磊吴润
- 关键词：PI3K/AKT渥曼青霉素凋亡
- 朊蛋白在癌症发生中的作用被引量：4
- 2015年
- 正常细胞型朊蛋白(PrPC)是一种高度保守、在所有哺乳动物体内广泛表达的细胞表面糖蛋白,人类PrPC在胚胎发育早期即已表达。研究表明,PrP在多种癌症中表达,包括胃癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌(HCC)、口腔鳞状细胞癌(OSCC)等,影响这些癌症的发生与侵袭,并在多药耐性(MDR)获得中起重要作用。因此,朊蛋白有望成为治疗多种癌症的新靶标。论文就PrP的结构、功能及其在细胞功能和疾病发生发展中的作用,以及PrP在多种肿瘤发生发展、耐药性的作用等研究进行概述,并对PrP在癌症新型疗法未来发展中的潜在影响进行分析讨论,以期为PrP相关肿瘤病的防治方面做出贡献。
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
- 关键词：朊蛋白癌症过表达靶标
- 鸡朊样蛋白Doppel基因的克隆及其与PrP^C相互关系分析被引量：1
- 2015年
- 克隆鸡Doppel蛋白(ChDpl)基因(PRND)并初步分析其与正常细胞型朊蛋白(PrPC)的相互关系,为禽源Dpl结构与功能、Dpl与PrPC互作关系机制的研究提供理论依据与分子基础;以多物种Dpl氨基酸序列为基础,通过比对找到Dpl氨基酸序列保守区,设计简并引物并依据鸡的密码子偏好性对引物进行优化,以逐步降低其简并性。用此特异性引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增鸡PRND基因,并将其克隆到pMD-18-T载体,鉴定后将序列上传GenBank数据库。结合Dpl与PrPC相关研究初步分析两者的相互关系;多物种Dpl氨基酸序列比对发现,第11—150位(139个氨基酸残基)为Dpl氨基酸序列保守区,以此区域设计引物并进行PCR扩增,得到约417bp的目的条带,GenBank登录号为KP140962。综合分析PrPC与Dpl相关研究发现,尽管Dpl与PrPC具有相似的翻译后修饰和空间结构,但两者多表现为拮抗作用,即PrPC能够拮抗Dpl的神经毒作用,尤其是其N-端包含八肽重复区的第23—88位残基对于保护Purkinje细胞免受Dpl诱导的神经退化作用至关重要。禽源Dpl的成功克隆不仅填补了目前研究的空白,更在分子水平为后续研究Dpl结构与功能及其与PrPC的拮抗机制奠定了基础。
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
- 关键词：PRPC拮抗
- 鸡Akt基因mRNA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：1
- 2014年
- 为快速检测鸡细胞的增殖能力,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,建立鸡Akt基因mRNA的定量分析方法。根据GenBank中原鸡Akt基因和鸡β-actin基因序列,设计合成特异性引物,应用RT-PCR技术从DF-1细胞中扩增出目的基因的DNA片段,并将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin。分别以重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin为标准品建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测的标准曲线。结果显示,建立的RT-PCR标准曲线具有良好的线性关系和特异的单个峰,能够对样品进行稳定可靠的定量检测。采用本方法检测DF-1-PrP和DF-1-count细胞系的Akt基因的相对表达量,前者为1.656 9×103,后者为2.257 4×102,DF-1-PrP细胞系的Akt基因表达量明显高于DF-1-cont细胞系(P<0.01),说明PrPC及Akt在DF-1细胞系中的表达量呈正相关。结果表明,本研究建立的鸡Akt RT-PCR检测方法能够通过对Akt基因的转录量进行检测而评价鸡细胞的增殖能力。
- 朱曼玲吴润于宏伟万学瑞刘磊刘霞张小丽贾晓蕊
- 关键词：AKT基因实时荧光定量RT-PCR
- PRNP基因SYBR GreenⅠ双标准曲线法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：5
- 2013年
- 为建立双标准曲线法荧光定量PCR检测方法,以PRNP为目标基因、β-actin为内参基因进行扩增,将扩增产物连入pMD18-T载体,获得阳性标准品进行定量扩增。并将MDV标准毒株MD5、疫苗株CV1988和1株野毒株接种CEF,收集不同日龄病变细胞以提取RNA,用以上方法进行扩增。把结果代入标准曲线公式进行计算,分析PRNP基因表达与MDV致瘤的相关性。结果显示,该方法能检测出的PRNP基因和β-actin基因的最低拷贝数为1×103,特异性和重复性较好。相对于对照组,接种3株毒株的PRNP的表达量都有明显的差异。表明MDV的感染对PRNP的表达量确实存在影响。据此推测PrPC对MDV的感染可能发挥着重要的生理功能。
- 艾文娜吴润刁小龙
- 关键词：实时荧光定量PCR
- 兰州市部分地区鸡马立克病流行病学调查被引量：2
- 2013年
- 旨在了解兰州市及其周边地区鸡马立克病的流行情况及流行毒株meq基因的分子特征,对该病的进一步预防及控制提供参考。随机采集集约化养殖场950份羽髓和950份血液样品,进行琼脂免疫扩散试验、PCR检测及meq基因的检测和序列比对。结果表明,马立克的平均抗原阳性率为1.47%,PCR检测阳性率为2.52%,meq基因检测阳性率为1.37%,此位点4株突变株与MDV各参考毒株同源性为98.8%～100.0%。可见,所得突变株都具有强毒株的特征,突变与毒力强弱存在一定相关性。
- 艾文娜吴润刁小龙李叙涟何轶群管宏伟罗鹏
- 关键词：马立克病流行病学琼脂免疫扩散PCRMEQ基因
- 鸡朊样蛋白Shadoo的基因序列与结构特征分析
- 2015年
- 根据GenBank收录的鸡SPRN(ChSPRN)序列设计特异性引物,以鸡脑组织基因组DNA为模板,无菌采集10只青脚麻鸡脑组织,克隆鸡朊样蛋白Shadoo的基因(SPRN)并分析其序列与高级结构特征,并应用生物信息学方法与软件进行分析,探讨其与PrP(朊蛋白)之间的相互关系.结果表明:ChSPRN长354bp,在第23位与第56位发生G→A、C→T突变,分别对应氨基酸序列C→Y、P→S突变,与GenBank中收录的鸡SPRN序列相比,两者核苷酸序列同源性高达99.7%,推导氨基酸序列同源性为99.9%.分析氨基酸序列并利用同源法构建ChSho与ChPrP的三级结构,结果显示它们N-端同源性为44.25%,C-端结构相似性为23.33%;ChSho与ChPrP在核苷酸、RNA二级结构、氨基酸水平以及高级结构中表现出的惊人相似性,推测其与PrP具有相似功能.
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
