国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-40-10)
- 作品数：11 被引量：63H指数：4
- 相关作者：窦永喜才学鹏骆学农朱学亮蒙学莲更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所宁夏大学河南科技学院更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目公益性行业(农业)科研专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 小反刍兽疫病毒细胞膜受体的鉴定被引量：1
- 2012年
- 【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pasto-ris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRV-tH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA),对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653bp的PPRVtH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,诱导表达后获得了60ku目的蛋白。重组tH蛋白免疫家兔后获得了效价为1∶200的抗血清。Western-blotting分析发现,该重组蛋白可与PPRV多克隆抗体发生特异性反应,山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上有2个与PPRV和重组tH蛋白结合的蛋白带,分子质量约为38和100ku。【结论】从山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上鉴定到了2种与PPRV结合的蛋白组分,其特性有待于进一步研究。
- 蒙学莲窦永喜翟军军闫丰超张海瑞石晓妮才学鹏
- 关键词：小反刍兽疫病毒病毒受体
- 绵羊CD46基因的克隆及真核表达
- 2014年
- 为了研究绵羊CD46蛋白的功能,根据从GenBank数据库获得的绵羊CD46基因的部分cDNA序列设计引物,以绵羊外周血淋巴细胞总RNA为模板,应用RACE方法扩增了绵羊CD46基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对CD46cDNA及CD46蛋白结构进行了预测分析。结果显示,绵羊CD46cDNA序列开放阅读框长1 083bp,编码由360个氨基酸残基组成的多肽,该多肽的理论分子质量为39ku,理论等电点为6.5。对该蛋白结构分析时发现,绵羊CD46第1~42位氨基酸残基为信号肽序列,共有5处N糖基化位点,4处蛋白激酶C磷酸化位点,5处Ⅱ-酪蛋白激酶磷酸化位点,7处N-豆蔻酰化位点。二级结构中无α螺旋,β折叠占26.1%,其余73.9%为转角,该蛋白具有4个结构域,与人源CD46的同源性较高。同时将CD46基因克隆到pCMV-Myc载体中,构建了真核表达质粒pCMV-Myc-CD46;将构建的重组质粒转染哺乳动物细胞CHO-K1以进行瞬时表达。Western-blot结果显示,CD46基因在真核细胞中成功获得了表达。上述研究结果为以后开展绵羊CD46的功能研究奠定了基础。
- 乔洋洋陈蕾孙铭苑朱学亮王海明窦永喜才学鹏
- 关键词：绵羊免疫印迹
- 绵羊Nectin 4基因的克隆与表达
- 2016年
- 采用巢式PCR方法获得未见报道的绵羊Nectin4基因。根据GenBank上登录的牛的Nectin4mRNA序列信息设计并合成10对引物;从绵羊肺支气管组织中提取总RNA,采用随机引物和Oligo(dT)将其反转录为cDNA;利用巢式PCR原理和PCR引物错配导致非特异反应的特点,改变常规PCR反应条件,将10对引物分为2组,通过两轮PCR即获得大小片段相符的片段;TA克隆后测序证实已成功获得绵羊Nectin4基因的完整ORF,证明本方法可作为一种获取未知基因的方法,较RACE等其他传统技术有明显优势;构建了重组表达质粒pCMV-Myc-Nectin 4,在CHO细胞的细胞质中获得高效表达,经Western-blot分析,表达的Nectin 4蛋白的大小与预期符合。绵羊Nectin4基因的成功扩增为后续对其在病毒入侵中的功能进行研究奠定了基础。
- 王秋霞郭利亚陈蕾窦永喜欧长波余燕张艳红马金友刘兴友才学鹏
- 关键词：蛋白质表达
- 小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗的构建及免疫原性被引量：4
- 2013年
- 为了寻求一种有效的疫苗用于预防小反刍兽疫(PPR),运用RT-PCR方法扩增PPRV的F基因并将其克隆到pCAGGS载体中,构建了真核表达质粒pCAGGS-F。将构建的重组质粒转染哺乳动物细胞上进行瞬时表达,通过Western-blotting、间接免疫荧光检测证实F蛋白得到了高效表达。将重组质粒作为DNA疫苗,通过脚掌皮内注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示,pCAGGS-F重组质粒在有无佐剂CpG的情况下均能诱导小鼠产生较高的抗体水平。
- 杨香芳窦永喜王秋霞骆学农曾巧英朱启运才学鹏
- 关键词：小反刍兽疫病毒DNA疫苗F基因免疫印迹间接免疫荧光
- 羊口疮病毒分子生物学的研究进展被引量：37
- 2013年
- 羊口疮病毒主要感染山羊和绵羊,近年来发现其也可感染包括人在内的多种动物,为一种人兽共患病。对羊口疮病毒的病原学、基因组结构、应用研究、免疫学特性等方面进行了综述,同时对已鉴定的几种病毒重要免疫调节蛋白和毒力基因及其功能进行了详细阐述,较为深入地探究了羊口疮病毒干扰宿主免疫系统及其免疫逃避的分子机制。
- 闫丰超邵佳窦永喜
- 关键词：羊口疮病毒基因组学毒力基因免疫调节
- 麻疹病毒属相关自噬的研究进展
- 2017年
- 自噬是一种复杂的细胞内生物学过程,受众多基因调控,存在复杂的调控网络,在不同组织器官、生理和病理状态所起的作用也不同。对20多个病毒科的50多种DNA或RNA病毒的研究发现自噬是把双刃剑,但在研究麻疹病毒属病毒自噬相关内容时发现自噬有利于病毒的复制与传播,并且H和F蛋白在麻疹病毒属诱导自噬方面发挥着重要作用。麻疹病毒能够通过RNA病毒诱导自噬的关键调控分子IRGM诱发自噬,并且CD46作为麻疹病毒属的受体分子,在诱导自噬发生方面发挥了至关重要的作用。此外,麻疹病毒属病毒诱发的自噬与其引起的免疫抑制之间可能存在密切关系。本文为麻疹病毒属的免疫学研究提供了参考。
- 梁忠祥朱学亮张志东窦永喜
- 关键词：自噬受体信号通路
- 小反刍兽疫病毒受体SLAM基因的克隆及其结构与功能分析被引量：1
- 2014年
- 信号淋巴激活分子(SLAM)为小反刍兽疫病毒(PPRV)感染其自然宿主的细胞受体。本试验从山羊外周血淋巴细胞中克隆获得了SLAM基因,并对其结构和功能的关系进行分析,为研究SLAM的功能及其在PPRV侵染过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR的方法对山羊SLAM基因全长进行克隆,通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对,利用Swiss-Model进行三级结构预测,然后分析其结构和功能之间的关系。山羊、绵羊、黄牛、水牛、虎鲸和海豚SLAM基因同源性较高,分别是98.7%、96.6%、96.3%、89%和88.8%,氨基酸的相似性分别是97.6%、94.1%、93.2%、83.5%和83.6%。山羊SLAM蛋白V结构域中存在8个影响宿主—病毒特异性结合的8个关键氨基酸,且与绵羊、黄牛和水牛的均完全保守;胞内区含有三段高度保守的富含酪氨基酸(Tyrosine)的基序(TXXYXXV/I/A)。本试验成功地克隆小反刍兽疫病毒受体SLAM基因,分析和预测了SLAM蛋白的结构和功能的关系,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。
- 蒙学莲窦永喜骆学农才学鹏
- 关键词：病毒受体SLAM克隆
- 启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证被引量：3
- 2014年
- 为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。
- 李继东朱学亮李辉骆学农窦永喜才学鹏
- 关键词：山羊痘病毒羊口疮病毒启动子P11
- 山羊痘病毒疫苗株ORF31/ORF117/ORF72编码蛋白的原核表达及抗原性分析被引量：2
- 2013年
- 为了研究羊痘病毒蛋白的功能,将羊痘病毒的DNA结合核衣壳蛋白(ORF31)、融合蛋白(ORF117)、蛋白磷酸酶(ORF72)3个基因分别克隆至pET-30a(+)原核表达载体后,转化大肠杆菌细胞。重组表达菌经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果显示3个重组蛋白均在原核细胞中获得表达,且大部分以包涵体形式存在,ORF117和ORF72蛋白有少量可溶性蛋白。表达产物经镍柱纯化后进行Western-blot分析,ORF72蛋白能与山羊痘阳性血清反应,证明ORF72蛋白具有免疫反应原性,另外2种蛋白则无反应原性。
- 邵佳闫丰超窦永喜朱学亮王秋霞骆学农许立华
- 关键词：山羊痘病毒原核表达抗原性分析
- 小反刍兽疫病毒样颗粒装配的研究被引量：4
- 2014年
- 为了探究小反刍兽疫病毒(PPRV)是否能够装配成病毒样颗粒(VLPs),选取PPRV的4个结构蛋白(基质蛋白M、核蛋白N、血凝素蛋白H和融合蛋白F)基因,分别构建其真核表达载体,利用间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况,并在Vero细胞上进行共表达,电镜下观察VLPs的装配情况。结果显示,构建的4个真核表达载体在Vero细胞上均得到了高效表达;共表达的4种蛋白在Vero细胞上成功装配并释放了PPRV VLPs,其形态和大小与PPRV Nigeria 75/1株感染细胞后观察到的病毒粒子的形态和大小一致。经免疫电镜检测,装配形成的VLPs能够识别特异性抗体。结果表明,本试验成功装配并释放了PPRV VLPs,为后续研制高效、安全的PPR新型疫苗奠定了基础。
- 王秋霞杨香芳窦永喜蒙学莲欧长波姜金庆骆学农王丽荣胡建和刘兴友才学鹏
- 关键词：小反刍兽疫病毒结构蛋白病毒样颗粒
