国家自然科学基金(39630020)
- 作品数：16 被引量：36H指数：4
- 相关作者：王海涛杜桂鑫侯利华武力闻玉梅更多>>
- 相关机构：军事医学科学院上海市传染病医院复旦大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市科学技术发展基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 丙型肝炎病毒RNA聚合酶可溶性和抗原性的研究被引量：1
- 2001年
- 目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶，研究其可溶性的条件，进一步研究它的抗原性，为研究其活性打下基础。方法构建表达载体 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在 Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱导条件下分析其可溶性，在获得ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１可溶性蛋白后，通过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化。纯化后得到的目的蛋白进行ＥＬＩＳＡ和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果在 Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△ Ｃ２１重组蛋白，二者在 ３７℃诱导条件下均以包涵体形式存在，ｐＱＥ－５Ｂ－△２１重组蛋白在１８℃诱导条件下５０％以可溶形式存在，通过ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表明该蛋白具有抗原性。结论在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶有良好的可溶性及抗原性。
- 侯利华杜桂鑫来大志王海涛
- 关键词：肝炎病毒丙型RNA聚合酶ELISA
- 丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究被引量：4
- 2000年
- 对 2例HCV持续性感染者 2个时间点NS3区C末端克隆测序 ,研究HCVNS3蛋白一个辅助T细胞表位 (氨基酸位 12 4 8 12 61)在HCV感染者体内的保守性 ;人工合成该表位进行淋巴细胞增殖试验和抑制试验 ,观察该表位引起免疫应答的水平和特点 ;通过“刺激 休息 刺激”多轮循环建立该表位特异性的T细胞系 ,并用流式细胞仪鉴定表型。结果发现该表位在 2个病人 2个时间点均未变化 ;观察的 2例HCV持续性感染者和 1例感染恢复者均对该表位有较强CD4 +T细胞应答。建立了针对该表位的表型均一的CD4 +辅助T细胞系。本研究提示该表位是一个序列保守的强辅助T细胞表位 ,对HCVT细胞疫苗的研制有一定意义。
- 徐俊杰汪涛齐连权王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒辅助T细胞表位T细胞系
- 两株乙型肝炎病毒基因组结构分析及其复制和抗原表达特性的比较被引量：4
- 2000年
- 为从全基因组水平研究乙型肝炎病毒 (HBV)的核苷酸结构及复制和抗原表达特性 ,分别从 2例HBsAg和HBeAg阳性、HBVDNA滴度为 10 14 和 10 13 拷贝 /ml的慢性乙型肝炎患者 (编号为 5 6和 2 18)血清中扩增、克隆了HBV全基因组 ,并测定了核苷酸序列。两株病毒基因组转染HepG2细胞的培养上清中HBsAg表达水平基本相同 ,但 # 5 6毒株表达的HBeAg约为 # 2 18株的 3倍 ,Southern印迹及核酸杂交显示 ,# 5 6HBV株复制效率显著高于 # 2 18株 ,两株HBVDNA全长均为 32 15个核苷酸 ,同源性为 98 7% ,均为B基因型 (adw亚型 )。两者相差的42个核苷酸分布在C、Pre S1、Pre S2、P及X基因编码区 ,其中有位于SPⅠ、SPⅡ、Xp和ENHⅠ基因调控序列区中。 # 5 6患者感染的毒株基因组中Pre S2起始密码ATG变异为GTG ,但由Pre S1起始翻译形成的大蛋白中包括Pre S2的部分氨基酸 ,故 # 5 6血清和 # 5 6株转染细胞的培养上清仍可与Pre S2抗体出现阳性反应。
- 武力袁正宏何丽芳蒋伟伦邱申熊闻玉梅
- 关键词：乙型肝炎病毒基因组抗原表达
- HCV螺旋酶N端HLA-A2限制性CTL表位的变异和CTL免疫应答
- 2004年
- 目的 :研究丙型肝炎病毒 (HCV)螺旋酶N端HLA A2限制性细胞毒性T细胞 (CTL)表位的变异及其增殖反应。方法 :对两例慢性HCV感染者随访 7年 ,用第 1年和第 5年的外周血提取病毒RNA ,再以RT PCR扩增HCV螺旋酶N端基因 ,并亚克隆及测序。根据测序结果 ,合成CTL抗原表位肽段。用血清学方法进行HLA分型。从感染者第 7年外周血中分离淋巴细胞 ,检测CTL对抗原肽的增殖反应。结果 :在具有HLA A2表型的感染者中 ,第 1年病毒抗原表位的起始氨基酸均存在琥珀突变 ,5年后该突变消失。在无HLA A2表型的感染者中 ,其感染后 5年病毒抗原表位肽段既无共有序列的变异 ,也无琥珀突变。HCV感染后 7年 ,两例感染者的淋巴细胞对该抗原表位肽段均无增殖反应。结论 :螺旋酶N端抗原表位出现的无义突变 ,可能与病毒的免疫逃避有关。在慢性感染的后期 ,病毒感染者对螺旋酶N端的CTL表位肽不出现免疫应答。
- 郭华章王文亮汪涛
- 关键词：表位细胞毒性T细胞淋巴细胞增殖
- 克隆的丙型肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列
- 2001年
- 探讨丙型肝炎病毒 ( HCV)准种在 NS2区的基因结构特征。利用逆转录 -巢式 PCR从一份 HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得 HCV NS2全长 c DNA,将其克隆于 T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示在克隆到的 HCV NS2全长基因中 ,慢性携带者该区序列有一个于 HCV多聚蛋白第 83 5位氨基酸的位置出现终止信号 ,丙肝患者该区序列有三个于第 83 5位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个小于第 887位氨基酸的位置出现终止信号。在克隆到的 HCV NS2基因中存在多个 N端终止突变序列 ,提示 NS2
- 冷彦陈秀珠叶嗣颖杜勇杜桂鑫王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒NS2基因结构
- 乙型肝炎病毒变异株功能基因组研究及其临床意义被引量：4
- 2001年
- 综述了近年对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）变异株的复制、免疫学特性、致病性、耐药性等功能基因 组研究及其临床意义的研究进展，阐述基因组水平研究ＨＢＶ变异株功能的重要性及有关结果，展望今 后ＨＢＶ变异株生物学特性研究的方向。
- 武力闻玉梅
- 关键词：乙型肝炎病毒基因变异抗原性免疫原性
- 丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究被引量：1
- 2002年
- 以杆状病毒 -昆虫细胞表达系统Bac-to -Bac为模型 ,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨。根据核心蛋白的亲水性分析结果 ,设计了三种长度的基因片段 (C173 、C191和C2 15) ,经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染 ,获得三种重组病毒 (rvBACC173 、rvBACC191和rvBACC2 15)用于表达分析。SDS -PAGE电泳和免疫印迹试验表明 ,昆虫细胞能够识别核心蛋白第 191和 192位氨基酸之间的切点并低效率切割 ;但不能够识别 173～ 191位之间的切点。间接免疫荧光试验表明 ,截断型核心蛋白C173 定位于细胞核内 ,而C191和C2 15则停留在细胞浆中。rvBACC173 感染的细胞在核内出现单一的“类晶体样结构” ,电子显微镜分析证实 ,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体。试验结果还表明 ,第 173至 191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达 ,并且影响蛋白在细胞内的分布。间接ELISA实验证实 。
- 杜桂鑫侯利华童贻刚王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白昆虫细胞
- 丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认被引量：4
- 2003年
- 目的 用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法 在原核系统中表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,亲和层析纯化血清中抗HCVNS5ab的特异多抗 ,用此多抗来筛选噬菌体递呈随机 12肽库 ,获得HCVNS5ab区的B细胞表位。结果 成功地表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,用此蛋白检验了 130份HCV阳性血清 ,阳性率为 36 %。在筛选的噬菌体展示随机肽库后 ,挑取 13个阳性克隆测序 ,有 9个序列不同 ,最终通过噬菌体表位表达的方法确认了 3个表位。
- 侯利华杜桂鑫王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定被引量：4
- 2002年
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达 ,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后 ,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛 ,挑选的 44个克隆中有 3 7个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶 ,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对 1 3个克隆进行序列测定 ,得到 6种序列 ,它们在氨基酸组成上存在明显偏性 ,富含组氨酸和色氨酸 ,缺乏酸性氨基酸 ;
- 杜桂鑫侯利华陈万荣张永国王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽噬菌体展示肽库
