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国家重点基础研究发展计划(2012CB114401): 作品数：18 被引量：27H指数：4; 相关作者：刘庆慧黄倢万晓媛孙新颖吴垠更多>>; 相关机构：中国水产科学研究院黄海水产研究所上海海洋大学国家海洋局第三海洋研究所更多>>; 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金山东省“泰山学者”建设工程项目更多>>; 相关领域：农业科学天文地球生物学更多>>

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Tetraspanin-3与WSSV的体外相互作用被引量：1: 2015年; Tetraspanin-3是四跨膜蛋白超家族的一员,在信号转导和免疫等过程中起到重要作用。本研究将中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Tetraspanin-3(FcT_3)的大胞外环区(Large extracellular loop,LEL)基因片段克隆,与原核表达载体p BAD/gⅢA连接,获得重组表达载体p BAD/gⅢA-T3L,转化入大肠杆菌TOP 10中,用L-阿拉伯糖(L-Arab)诱导并经钴离子亲和层析纯化得到重组蛋白。质谱分析显示,纯化的重组蛋白为FcT_3。用地高辛将FcT_3L标记并与WSSV作用,Far-western分析显示,FcT_3L与VP26结合。ELISA实验结果显示,FcT_3L与VP26蛋白的相互作用随VP26量的增加而增强。推测FcT_3通过与VP26作用介导病毒核衣壳的入胞过程。; 关广阔刘庆慧黄倢; 关键词：中国明对虾 WSSV 相互作用

2016-2017年我国部分地区白斑综合征病毒wsv006的变异分析被引量：2: 2018年; [目的]了解wsv006蛋白结构变异情况,并进一步为其蛋白功能研究提供参考资料。[方法]以2016和2017年在全国18个地区采集的WSSV阳性样品为模板,采用PCR方法,用特异性引物扩增wsv006基因,经连接转化后进行测序,并对测序结果进行分析。[结果]在2016年的47份样本中有9个样本,包括河北黄骅、山东日照、河北沧州和河北唐山4个地区的样本中出现了wsv006目的条带,检出率为19%。在2017年的39份WSSV阳性样本中有16个样本,包括福建霞美镇、河北黄骅、广东湛江、山东滨州、山东东营和上海6个地区的样本中出现了wsv006的目的条带,检出率为41%。氨基酸序列比对结果显示,扩增的wsv006编码氨基酸变异包括氨基酸替换、插入、缺失和提前终止翻译,其中插入的主要是脯氨酸(P)和苏氨酸(T),插入位点在第151～166位,处于PT的交叉重复区域;终止翻译是由于核苷酸第541位插入了GAGG,在转录过程中形成了终止密码子。[结论]wsv006氨基酸序列存在明显变异。; 蔡苗刘庆慧万晓媛黄倢; 关键词：WSSV

2017年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区的序列分析被引量：2: 2019年; 白斑综合征病毒(WSSV)自暴发以来给全球范围内的对虾养殖产业带来了巨大的损失。为了解我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖区WSSV的流行变异情况,选取2017年中国部分地区的42个WSSV阳性样本,对ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125共5个可变区进行PCR特异性扩增,分析其序列的缺失变异和重复单元(Ru)中单核苷酸多态性的变化。研究结果显示,在ORF14/15的扩增中共出现4种缺失片段;ORF23/24只出现11945bp的缺失片段;ORF75扩增中,总RUs数目为3、4、9,其中45bp的RUs在12、27、80位点发生多核苷酸多态性;ORF94的RUs数目为6,其各重复单元在48位发生单核苷酸多态性;ORF125的RUs数目为4、6、7不等,其各重复单元分别在20、27、50、53、61位发生碱基突变。研究结果表明,2017年样本中,WSSV在中国大部分地区均出现一定程度的缺失变异,其中部分可变区表现出缺失情况的稳定性,某些可变区的重复单元数目及SNP表现出地区的差异性以及不稳定性。; 刘晓娉孙新颖刘庆慧万晓媛黄倢; 关键词：WSSV

2014年中国不同地区对虾白斑综合征病毒ORF14/15和ORF23/24缺失区序列比较被引量：4: 2016年; 对虾养殖面临诸多病害威胁,对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是养殖对虾主要病原之一,WSSV不同地理株的变异可能导致WSSV毒力的变化。为了解2014年中国大部分地区WSSV ORF14/15和ORF23/24的变异情况,本研究选择2014年1月–8月期间采集的48份WSSV阳性样本,用特异引物扩增ORF14/15和ORF23/24片段,连接于T载体,转化至Top10中,筛选阳性克隆,测序分析不同样本之间的缺失差异。结果显示,能够扩增ORF14/15和ORF23/24样品的比例分别为43.75%和33.33%。在ORF14/15扩增中,分别扩增出1260 bp、1270 bp、1892 bp和2662 bp片段,与TH-96-Ⅱ比对共有4种缺失情况,即缺失6540 bp、6530 bp、5908 bp和5138 bp。而在ORF23/24扩增中,分别扩增出1140 bp和1146 bp片段,与中国台湾株(TW)比对有两种缺失情况,即缺失12070 bp和12064 bp。研究结果表明,WSSV在中国大部分地区存在一定程度的变异,而不同毒株之间在ORF14/15可变区差异比较明显,在ORF23/24可变区差异不大,但均具有大片段缺失。; 孙新颖刘庆慧万晓媛黄倢; 关键词：WSSV

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)coat-ε基因全长cDNA克隆及组织分布被引量：2: 2016年; coat-ε基因表达的蛋白是组成COPⅠ的coatomer复合体的一个亚基,为获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)coat-ε基因全长序列,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技术,扩增出coat-ε基因的3端和5端,测序结果经DNAMAN比对拼接得出coat-ε基因全长,基因全长1402 bp,5非编码区(UTR)84 bp,3'非编码区(UTR)310 bp,开放阅读框1008 bp,预测编码335个氨基酸,其中,第230–300的氨基酸属于TPR超家族,Signal P 3.0 Server预测氨基酸序列没有信号肽,TMHMM Server v.2.0分析此氨基酸不存在跨膜结构,PSORTⅡPrediction预测该蛋白位于线粒体、细胞质、内质网中,属胞内蛋白。系统进化树显示,中国明对虾的coat-ε基因与节肢动物门的动物亲缘关系相近。采用实时荧光定量方法分析该基因在鳃、上皮、胃、肌肉、肝胰腺等不同组织中的相对表达,结果显示,coat-ε在肌肉中的相对转录表达量最高,在鳃和附肢的表达次之。本研究获得的中国明对虾coat-ε全长序列,可为该基因功能研究提供基础。; 王修芳刘庆慧吴垠黄倢; 关键词：中国明对虾基因克隆

对虾白斑综合症病毒透射电镜分析中病毒固定条件的优化: 2013年; 电镜观察是研究对虾白斑综合症病毒(WSSV)形态和结构的重要手段.本研究采用不同浓度的多聚甲醛和戊二醛对纯化的WSSV粒子进行固定,从中寻找最优的固定条件用于病毒的透射电镜(TEM)分析.实验结果显示,经过多聚甲醛或者戊二醛固定的WSSV粒子对吸附、染色等实验操作的耐受性较未固定样品有显著提高,在制样过程中没有发生明显的结构破坏.其中1.00%(V/V)多聚甲醛常温固定20 min对WSSV粒子的结构保持得最好.进一步地分析表明,1.00%多聚甲醛固定后的病毒粒子更有利于金标免疫电镜的研究.; 邬君君谷力李钫; 关键词：海洋生物学对虾白斑综合症病毒多聚甲醛戊二醛

2016年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区序列的分析比较被引量：3: 2018年; 为探究中国白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的分子流行病学变异情况,选取2016年1-7月从我国3省9市采集到的47份WSSV阳性样本,提取WSSV核酸后,使用特定引物对目的片段进行扩增,继而进行测序并分析比较不同地区样本的ORF14/15和ORF23/24序列缺失情况,ORF75、ORF94和ORF125的VNTR及SNPs变化情况。结果显示,在ORF14/15的扩增中,有4种缺失片段,分别是6 540 bp、6 530 bp、5 950 bp和5 140 bp,而在ORF23/24扩增中则有3种大片段缺失,分别是12 073 bp、12 070bp和11 945 bp,在所有样本中ORF75的RUs数目分别为11、8、10、3,ORF94的RUs数目分别为5、7、8、11、14,ORF125的RUs数目为4、5、6。SNPs分析结果表明,ORF94片段中含有5个和8个RUs的在48位的碱基均为T,含有7个RUs的在48位的碱基为T、G、G、G、G、T、T,含有11个RUs的在48位的碱基为T、T、T、T、T、T、G、T、G、T、T,含有14个RUs的在48位的碱基为T、T、T、T、G、G、T、G、G、T、T、T、T、T,含有所有RUs数目的ORF125片段在8、18、25、66和69位置的碱基均为G、G、G、G和A,,而在9、50、53、61和63位的碱基则出现了4种变异。研究结果表明,2016年的样本中,WSSV毒株存在一定程度的变异情况。主要表现在ORF14/15和ORF23/24均出现了新的缺失片段,ORF75、ORF94和ORF125的VNTR以及SNPs变异情况也存在明显差异。; 蔡苗孙新颖刘庆慧万晓媛黄倢; 关键词：白斑综合征病毒单核苷酸多态性

红螯螯虾网格蛋白轻链的克隆及制备抗体的检测被引量：1: 2016年; 网格蛋白为三脚蛋白复合体,其介导的内吞作用是病毒侵染细胞的常用途径之一.而对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业的主要病原,为了研究分析WSSV的侵染机制及进入宿主细胞的途径,在本研究中,克隆得到红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)网格蛋白轻链的c DNA全长,并将其命名为Cq CLC(Genbank登录号为KR075008).进化树分析表明,其与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的网格蛋白轻链进化距离较近.此外,在其蛋白序列中选择抗原性较好的片段合成多肽,并以此制备单克隆抗体,而后经免疫荧光和western blot检测从中筛选出具有特异性的抗体,为进一步对WSSV侵染虾细胞机制及入胞途径的研究奠定了基础.; 黄家骏李钫杨丰; 关键词：海洋生物学红螯螯虾克隆抗体特异性

对虾白斑综合症病毒结构蛋白质VP12的研究: 2013年; VP12是对虾白斑综合症病毒的一种结构蛋白,该蛋白质由病毒基因wsv009编码,分子量为10.9kDa.转录时相分析表明wsv009属于早期基因.本研究通过PCR扩增获得了该全长基因,成功构建了重组质粒pET-His-vp12.将该质粒转化到E.coliBL21中表达并纯化了重组VP12蛋白,用该重组蛋白制备了特异性鼠抗血清.纯化的病毒粒子经0.5%Triton X-100处理后,VP12被发现存在于病毒WSSV的囊膜部分,Western blot杂交实验和免疫电镜实验也证实该结果.对VP12的深入研究将有助于了解病毒的感染和包装的机制,为病毒的诊断和控制提供科学依据.; 李建波邬君君杨丰; 关键词：海洋生物学对虾白斑综合症病毒免疫电镜

利用酵母双杂交技术筛选与wsv112互作的宿主蛋白被引量：2: 2019年; 对虾白斑综合征病毒(WSSV)开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)。为研究wsv112与宿主的互作关系,本研究采用酵母双杂交Gal4系统从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道cDNA文库中筛选与wsv112互作的候选蛋白。以WSSV为模板,构建pGBKT7-112诱饵载体,转化到Y2H Gold酵母菌感受态细胞中,转化菌液涂布到不同缺陷型培养基上,检测诱饵载体的自激性和毒性。将凡纳滨对虾肠道cDNA文库与诱饵菌株pGBKT7-112接合,通过筛选力度不同的缺陷型培养基、颜色反应、PCR、测序鉴定等步骤筛选阳性克隆,将阳性菌株提取质粒,再经过回复杂交实验验证筛选出的阳性质粒与诱饵载体的作用。研究表明,诱饵载体pGBKT7-112无自激性和毒性,可用于酵母双杂交实验;经初筛和回复杂交实验最终得到2个阳性质粒,经过NCBI数据库对比,其编码的蛋白分别与日本囊对虾(Penaeus japonicus) C型凝集素(AGW27416.1)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 40S核糖体蛋白S20小亚基蛋白(ALE99171.1)具有37%和98%同源性。本研究为wsv112的调控机制提供新的线索。; 王中一刘庆慧卢翠玉黄倢; 关键词：对虾白斑综合征病毒 DUTPASE 酵母双杂交

国家重点基础研究发展计划(2012CB114401)

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