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粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性被引量：22: 2006年; 粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)是粉尘螨Dermatophagoidesfarinae主要变应原,可引发Ⅰ型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出DerfⅠ片段,产物连接入T载体(pMD18)。经扩增后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段连接到pET24a表达载体上,得到重组质粒pET24a-DerfⅠ,工程菌经IPTG诱导培养,高效表达出DerfⅠ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用Westernblot及ELISA方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。; 朱健琦刘志刚高波吉坤美邢苗; 关键词：粉尘螨变应原纯化

尘螨连续石蜡切片的制备及染色技术被引量：5: 2007年; 研究尘螨连续石蜡切片的制备技术。利用琼脂预包埋后再以塑化石蜡包埋,经切片和HE染色,获得结构完整、定位准确、染色清晰的连续切片。探讨制片过程中一些步骤的改进和注意事项,为尘螨显微结构的形态学研究提供可能,也为免疫组化、原位PCR及过敏性疾病尘螨特异性变应原的定位等研究奠定良好的基础。; 张莺莺刘志刚孙新包莹李盟; 关键词：尘螨琼脂 HE染色

深圳地区粉尘螨Ⅱ类变应原基因的多态性分析及其表达蛋白的变应原性鉴定被引量：5: 2007年; 粉尘螨Ⅱ类变应原（DerfⅡ）是粉尘螨Dermatophagoides farinae主要变应原之一,可引发Ⅰ型变态反应。从深圳地区挑取活粉尘螨,经形态鉴定后纯培养,提取其总RNA,RT-PCR扩增出DerfⅡ基因,克隆到pMD18-T载体后测序。通过计算机软件分析该基因的多态性。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-DerfⅡ。工程菌经IPTG诱导培养,表达DerfⅡ目的蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。重组DerfⅡ蛋白通过6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western blot检测该重组蛋白与对粉尘螨过敏患者血清中IgE的反应性。结果表明,克隆的5株深圳地区的DerfⅡ基因与GenBank公布的DerfⅡ（AB195580.1）核苷酸序列同源性为96.8%～99.3%,推导的氨基酸序列同源性为93.8%～98.6%。表达纯化的5种重组DerfⅡ蛋白经Western blot检测,表明都具有良好的变应原性。; 白羽吉坤美刘志刚蔡成郁; 关键词：粉尘螨变应原基因多态性原核表达

利用套式PCR技术鉴别屋尘螨和粉尘螨主要变应原基因及其在尘螨疫苗研制中的应用被引量：4: 2007年; 通过提取屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子基因组DNA作模板,分别设计Der p1和Der f1各2套内外扩增引物并进行一步法套式PCR,根据扩增出目的片段来检测尘螨变应原Der p1和Der f1基因片段,并以培养基提取物为阴性对照和已通过形态学鉴别为纯屋尘螨、纯粉尘螨的基因组DNA为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并在GenBank中进行同源性比较。结果显示,从屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子分别扩增出含有屋尘螨和粉尘螨主要变应原Der p1和Der f1基因片段,扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的基因片段,从阳性对照DNA提取物中能扩增得到目的变应原Der p1和Der f1基因片段。本研究首次应用套式PCR技术鉴别了屋尘螨和粉尘螨原始种子和生产种子,为尘螨疫苗研制以及工业化生产提供了一种有效的质量控制手段。; 白羽吉坤美刘志刚包莹李盟; 关键词：尘螨 P1 套式PCR 疫苗

屋尘螨Ⅰ类变应原Der p1的体内定位被引量：11: 2005年; 对过敏性疾病主要过敏原屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinusⅠ类变应原(Der p1)进行了抗原定位研究。选用经表达和纯化的Der p1抗原蛋白,按常规方法免疫小鼠,分离血清获抗重组Der p1的抗体(Ⅰ抗),用抗鼠IgG荧光抗体为Ⅱ抗,屋尘螨经石蜡切片,在荧光显微镜下对其特异性变应原的定位进行观察。HE染色显示屋尘螨消化系统占据大部分体腔。组织免疫荧光发现屋尘螨Ⅰ类变应原主要定位于螨的中肠组织及肠内容物,而螨的生殖系统、排泄系统等脏器以及几丁质甲壳均呈阴性反应。据此认为屋尘螨Ⅰ类变应原存在于螨的肠内容物和中肠组织中。; 刘志刚李盟包莹付仁龙苏东明; 关键词：屋尘螨 P1 抗原定位 HE染色免疫染色

粉尘螨消化系统的形态学观察被引量：3: 2007年; 光镜下观察了粉尘螨Dermatophagoidesfarinae消化系统结构,其组成包括:口前腔、前肠、中肠、后肠、肛门和唾液腺。口前腔由颚体围绕而成;前肠包括一个肌肉的咽和食道,食道从脑中穿过;中肠分为前中肠(包括一对盲肠)和后中肠,中肠的上皮细胞呈现多种形态;后肠包括相对大的结肠和狭窄的直肠;消化腺为不规则形,位于脑前方。本文阐述了消化道的分支情况、显微结构及细胞形态。; 张莺莺刘志刚孙新包莹李盟; 关键词：粉尘螨形态学

粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性被引量：6: 2006年; 目的获得大量具有良好的IgE结合活性的Der fⅡ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Der fⅡ片段,产物连接进入T载体(pMD18)。经扩增后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段连接到pET-24a表达载体上,得到重组质粒pET-Der f2,工程菌经IPTG诱导培养,明显表达出Der fⅡ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用Western blot检测免疫学活性。结果成功提取粉尘螨的总RNA,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段。序列分析结果和Genebank上的基因序列(D10448)同源性98%,其中有6个碱基不同。使用高效表达的原核载体pET,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签。表达质粒在E.coliBL21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性。结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展Der fⅡ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。; 朱健琦刘志刚高波吉坤美邢苗; 关键词：粉尘螨变应原纯化

粉尘螨I类变应原基因的多态性分析及表达蛋白的特性鉴定被引量：7: 2007年; 目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。; 白羽吉坤美刘志刚蔡成郁; 关键词：粉尘螨基因多态性原核表达

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广东省重大科技专项(2003A3080502)

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