国家高技术研究发展计划(2012AA101602)
- 作品数：15 被引量：80H指数：6
- 相关作者：方维焕章先宋厚辉张亚军金庆日更多>>
- 相关机构：浙江大学浙江农林大学宁波出入境检验检疫局更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学轻工技术与工程生物学医药卫生更多>>
- 基于量子点标记的赭曲霉毒素A快速、高灵敏荧光免疫层析检测方法的建立及应用被引量：10
- 2019年
- 赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)具有肾毒性、致畸性、致癌性和免疫毒性,广泛存在于各种粮食作物及其副产品中,是食品和饲料原料的重要污染物,可在人类及动物体内蓄积,在已知发现的真菌毒素中,重要性和危害性仅次于黄曲霉毒素。本研究通过采用量子点荧光微球(quantum dots,QDs)标记OTA单克隆抗体,并基于免疫层析原理,优化、建立了OTA高灵敏荧光免疫层析检测方法(FICGA),15min即可实现对农产品中OTA污染的快速定量检测。该方法检测下限(IC10)达到0.04ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.05–0.59ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.18ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为7.3%和11.9%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1和DON均无交叉反应。在玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达83.2%–117.8%,与LC-MS/MS同时对天然样本中OTA含量的检测结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的FICGA快速、灵敏,可满足基层单位和现场的快速检测需求,具有很好的应用前景。
- 杨眈王作欢蒋小武方维焕方维焕章先
- 关键词：赭曲霉毒素A免疫层析量子点单克隆抗体
- 基于纳米金和辣根过氧化物酶双标记抗体的黄曲霉毒素B_1高灵敏检测方法的建立及应用被引量：7
- 2018年
- 黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)在自然界普遍存在,可污染多种粮食作物和饲料,给动物和人类健康造成严重威胁。为建立AFB_1高灵敏度的快速检测方法,本研究通过采用纳米金颗粒(Au nanoparticles,AuNPs)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)双标记AFB_1单克隆抗体,建立新型酶联免疫检测方法(HRP-AuNPs IC-ELISA),检测下限(IC10)为0.017ng/mL,检测区间(IC_(20)–IC_(80))为0.026–0.376ng/mL,半数抑制率(IC_(50))为0.099ng/mL,与黄曲霉毒素B2、G1、G2和M1的交叉反应率分别为2.7%、9.3%、2.1%和5.3%,与赭曲霉毒素A、伏马毒素B_1、桔青霉素、展青霉毒素和玉米赤霉烯酮几乎不存在交叉反应。在玉米和面粉样本中的加标回收率可达88.93–103.55%,与LC-MS/MS同时对天然样本中AFB_1含量进行检测,结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的HRP-AuNPs IC-ELISA耗时短且灵敏度高,可用于实际样本中AFB_1的快速定量检测与分析,也为其他霉菌毒素的精准检测技术开发提供参考。
- 章先章先付子贤周一钊方维焕宋厚辉
- 关键词：黄曲霉毒素B1纳米金颗粒辣根过氧化物酶单克隆抗体
- 纳米颗粒应用于金葡菌A型肠毒素检测的综合实验设计
- 2022年
- 该文将科研项目成果与医学专业实验教学相结合,在病原生物学与免疫学实验教学中设计了“纳米颗粒在金葡菌A型肠毒素检测中应用”的综合实验项目。基于酶联免疫原理,通过制备纳米磁珠-抗体复合物和纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)双标记抗体,提高检测灵敏度。纳米磁珠-抗体可在外磁场的作用下实现目标物质的快速富集和分离,纳米金-辣根过氧化物酶形成的多聚HRP可提升催化效果。单克隆抗体分别标记后与待测的金葡菌A型肠毒素混合反应,形成夹心复合物,通过底物四甲基联苯胺(TMB)的显色进行定量分析。与常规夹心ELISA比,该方法方便快捷、灵敏度高,有助于加深学生对酶标记和免疫检测技术的掌握,激发其科研兴趣。
- 章先王继璇谢珲时玉菲李肖梁
- 关键词：实验教学
- 黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测技术研究被引量：24
- 2015年
- 【目的】制备黄曲霉毒素B1单克隆(AFB1)抗体,建立间接竞争ELISA检测方法用于污染样品中AFB1的检测。【方法】用碳二亚胺法制备黄曲霉毒素B1的完全抗原AFB1-BSA后免疫Balb/c小鼠,经过细胞融合和克隆化筛选获得抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备抗体,通过间接ELISA方法分别测定抗体亚类和效价。经优化实验条件,建立稳定的间接竞争ELISA检测方法,并用于检测饲料样品中的黄曲霉毒素B1。【结果】获得4株稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选择3B9细胞株制备抗体,测定抗体亚类为Ig G1,效价为1:204 800,与黄曲霉毒素B2、G1、G2和M1的交叉反应率分别为2.2%、33.9%、1.8%和4.1%,与赭曲霉毒素A、伏马毒素和玉米赤霉烯酮几乎不存在交叉反应。以此单抗构建了AFB1间接竞争ELISA检测方法,在AFB1浓度为1.04-25.00μg/L范围内呈线性(R2=0.993 1),检测限为1.04μg/L,半数抑制率(IC50)为6.03μg/L,平均加标回收率在线性范围内可达85%-120%,变异系数均小于10%。【结论】通过饲料样品检测证实,该方法与进口ELISA试剂盒检测一致性良好,可用于实际样品中黄曲霉毒素B1的快速筛检。
- 谢珲章先王歆凡鹏程时玉菲方维焕
- 关键词：黄曲霉毒素B1单克隆抗体间接竞争ELISA
- 核酸适体检测赭曲霉毒素A荧光方法的建立被引量：3
- 2015年
- 赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)普遍存在于谷物等粮食和动物饲料中,是一种可以引起癌症的霉菌毒素。为了快速检测OTA,利用荧光染料PicoGreen识别双链DNA原理,建立了一种基于核酸适体与PicoGreen检测毒素OTA的方法。在10 mmol/L Tris,120 mmol/L Na Cl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH8.5)缓冲液中,PicoGreen与双链DNA结合后,释放的荧光在3 min内达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。从加样到荧光检测,整个流程可在40 min内完成。检测OTA的灵敏度为1μg/L;检测范围为1μg/L^200μg/L。特异性实验表明:OTA核酸适体-Pico Green方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法在检测敏感性和特异性方面与传统抗体ELISA方法相当(Kappa值为:0.857)。由于核酸适体成本比抗体低,因此本方法比抗体ELISA方法更具实用价值。
- 桂海娈金庆日张亚军王晓杜杨永春邵春艳程昌勇卫芳芳杨杨杨梦华宋厚辉
- 关键词：赭曲霉毒素A核酸适体荧光
- 基于光激活定位显微镜的膜蛋白鉴定技术被引量：1
- 2012年
- 病原菌膜蛋白的原位标记和定位追踪是一项非常繁琐的工作。为了建立一种可以用于快速鉴定膜蛋白、且分辨率达到纳米级别的膜蛋白荧光定位技术,将结核分枝杆菌外膜蛋白OmpA与具有光敏活性的蛋白mEos2m在无致病性的耻垢分枝杆菌中进行融合表达。重组菌固定在载玻片上后,利用405 nm激光激活mEos2m。利用普通荧光体视显微镜、正置荧光显微镜和超分辨率光激活定位显微镜观察OmpA-mEos2m,分析融合蛋白在细菌内的分布情况,并捕获光激活蛋白在细胞膜上释放的光子信号。通过超分辨率光激活定位显微镜,发现OmpA-mEos2m融合蛋白在细胞膜上呈"带"状环绕分布,这是观察到膜蛋白在细胞膜上定位的最直接证据。mEos2m与OmpA融合表达后,并不改变OmpA的膜蛋白属性和定位特征。因此可以将mEos2m用于其他非多聚体膜蛋白的融合和定位研究。可以应用非致病性的耻垢分枝杆菌作为模型,采用高分辨率活菌成像技术,研究致病性的结核分枝杆菌蛋白结构、定位和功能。这是目前为止国内采用光激活定位显微成像技术研究膜蛋白的首次报道。
- 黄丽方维焕俞盈宋厚辉
- 关键词：结核分枝杆菌膜蛋白光子
- 基于荧光染料PicoGreen和核酸适配体的伏马毒素B_1检测方法被引量：9
- 2015年
- 伏马毒素B1是主要存在于玉米及玉米制品中的一种可以引起癌症的霉菌毒素。针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。本研究利用核酸适配体与伏马毒素B1结合后不再结合其互补核酸序列的选择性以及Pico Green与双链DNA结合的特异性,开发了一种快速检测伏马毒素B1的适配体方法。Pico Green与双链DNA反应15 min后激发产生的荧光达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1 ppb),线性范围为0.1-1μg/L(0.1-1 ppb),整个检测流程可在40 min内完成。特异性试验显示伏马毒素B1适配体与黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等常见霉菌毒素无交叉反应。结果表明适配体方法与基于抗体的检测伏马毒素B1商品化ELISA试剂盒相当,Kappa值为0.857。由于核酸适配体比抗体成本低,检测时间短,因此基于核酸适配体的方法比基于抗体的ELISA方法更具有推广应用价值。
- 桂海娈金庆日张亚军王晓杜杨永春邵春艳程昌勇卫芳芳杨杨杨梦华宋厚辉
- 关键词：核酸适配体荧光染料PICOGREEN
- 结核分枝杆菌同源重组基因敲除系统的构建和应用被引量：6
- 2012年
- 【目的】结核分枝杆菌同源重组效率很低,突变株的构建需要半年之久。本研究的目的在于构建一种用于在结核分枝杆菌中进行基因快速敲除、且易于筛选的高效同源重组系统。【方法】野生型结核分枝杆菌转化含有SacB反向选择标记、且能诱导表达两种同源重组酶gp60和gp61的质粒pSL002。然后分别将靶基因的两个同源臂克隆入到含有hyg(潮霉素)抗性基因和gfp(绿色荧光蛋白)基因的重组质粒pSL001中,再将靶基因同源臂-loxP-hyg-gfp-loxP片段从pSL001切下,转化含有pSL002的野生型结核分枝杆菌,一步得到双交换突变株。再将含有SacB反向选择标记、且表达Cre重组酶的质粒pSL003转化入结核分枝杆菌双交换突变株中,切除两个loxP之间的hyg抗性基因和gfp基因,得到无痕缺失突变株。最后利用含有2%蔗糖的琼脂糖平板去除含有SacB反向选择标记的质粒pSL002和pSL003。【结果】在结核分枝杆菌中成功构建了高效同源重组系统,利用该系统构建了rv1364c、pstP跨膜区、pstP胞外区三个突变株,得到双交换突变株的效率为25%-62.5%,从双交换突变株得到无痕缺失突变株的效率为100%。通过gfp作为荧光标记基因,利用NightSea BlueStar蓝光手电筒和滤光眼镜,可以对平板上的基因缺失株直接进行快速判定。【结论】该同源重组系统利用gp60和gp61重组酶,在时间上将在结核分枝杆菌中无痕缺失突变株的构建从6个月缩短到3个月。这是目前为止在结核分枝杆菌中构建突变株最快且效率最高的方法,为加速分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。
- 武晓林方维焕俞盈宋厚辉
- 关键词：结核分枝杆菌同源重组基因敲除重组酶荧光标记
- 基于量子点阳离子交换反应检测金葡菌A型肠毒素的综合性实验设计
- 2022年
- 结合临床实际检测需求和免疫标记领域研究热点,设计了基于量子点阳离子交换反应检测金葡菌A型肠毒素的综合性实验,用于医学专业病原生物学与免疫学实验教学。利用量子点修饰金葡菌A型肠毒素单克隆抗体,制备了单克隆抗体-量子点荧光标记物,并优化了基于阳离子交换反应的量子点信号检测体系,最终应用于金葡菌A型肠毒素免疫学检测方法的建立。实验结果显示,所建立的基于量子点阳离子交换反应的金葡菌A型肠毒素免疫学检测法灵敏度高、特异性好。该综合性实验将相关理论原理与技术创新相结合,加深了学生对免疫标记与检测技术教学内容的理解,提高了专业操作技能,激发了科研兴趣。
- 章先王继璇丁伟勇谢珲时玉菲李肖梁
- 关键词：量子点阳离子交换实验教学
- 天冬酰胺酶介导的分枝杆菌酸适应机制
- 2012年
- 【目的】结核分枝杆菌可以在宿主细胞内的酸性环境中长期存活。为了探明天冬酰胺酶(AnsA)代谢通道介导的分枝杆菌在酸性环境中的适应机制,分别通过体内和体外实验,对AnsA的活性、突变体性质进行了分析。【方法】以无致病性的卡介苗分枝杆菌(M.bovis BCG)为模式菌,扩增天冬酰胺酶编码基因ansA并在大肠杆菌中进行表达和纯化,对AnsA的酶学活性进行了分析。在卡介苗分枝杆菌中将ansA敲除,对其抗酸、产氨等特性进行了研究。【结果】纯化的重组AnsA在体外可以将天冬酰胺分解并产生氨。在酸性培养基中,分枝杆菌利用天冬酰胺产生的氨,可以释放到培养基中,将酸性培养基中和。敲除ansA后,卡介苗分枝杆菌在酸性环境中的生长滞后10天左右。为了更好的理解天冬酰胺介导的抗酸机制,绘制了天冬酰胺代谢、氨产生和转运示意图。【结论】结核分枝杆菌的抗酸特性之一是通过分泌氨将周围的酸性环境中和来实现的。氨来源于分枝杆菌AnsA对底物天冬酰胺的分解。这为揭示结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内酸性环境中的生存机制提供了线索。
- 蔡潇浪吴蓓蓓方扬宋厚辉
- 关键词：天冬酰胺
