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蜕皮激素对家蚕卵黄原蛋白基因表达的调控被引量：2: 2014年; 蜕皮激素(20-hydroxy ecdysone,20E)是由前胸腺分泌的能调节节肢动物昆虫纲、甲壳纲等动物蜕皮的激素.家蚕属于完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育时期.20E在家蚕发育过程中有不可替代的作用.本研究通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定家蚕变态期前后血淋巴中20E滴度,发现在卵黄原蛋白基因(Bombyx mori vitellogenin,BmVg)高量表达前的雌雄血淋巴中20E含量没有明显差异,但含量变化趋势与BmVg表达趋势相一致.用20E注射上蔟后60 h的家蚕和添食5龄家蚕,能诱导雌性和雄性脂肪体中BmVg表达和蛋白合成.调查处理后的家蚕所产卵中的卵黄磷蛋白(BmVn)含量及重量,发现蚕卵中BmVn含量及蚕卵重量都明显增加;本研究还通过脂肪体体外培养,证明了20E是直接作用于脂肪体来诱导BmVg的表达.本研究结果表明,20E是通过诱导脂肪体中BmVg的转录来增加蚕卵中BmVn积累,从而最终使得蚕卵重量也相应增加.; 沈关望林英吕毅华王继岩邢润苗夏庆友; 关键词：蜕皮激素卵黄原蛋白家蚕基因表达

家蚕芳基贮藏蛋白新成员BmSP3的基因克隆与表达分析被引量：1: 2014年; 贮藏蛋白在家蚕幼虫5龄盛食期的脂肪体中高量表达,为家蚕变态发育提供重要的营养物质,已报道的家蚕贮藏蛋白成员包括BmSP1和BmSP2,其中BmSP2为富含芳香族氨基酸的芳基贮藏蛋白(arylphorin)。从家蚕5龄幼虫脂肪体中鉴定并克隆了一个新的芳基贮藏蛋白基因,命名为BmSP3(GenBank登录号:JQ043182)。该基因ORF全长2 091 bp,编码697个氨基酸,BmSP3与BmSP2具有较高的序列相似性。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测显示:BmSP3在家蚕5龄第3天幼虫的脂肪体、表皮、生殖腺和头部中均有表达,其中在脂肪体中的表达水平最高,并且同一组织中雌蚕的表达水平明显高于雄蚕;BmSP3在4龄末幼虫的脂肪体中就有表达,5龄中期表达水平开始明显增加,到上蔟前达到最高峰,之后急剧下降。Western blot检测显示:BmSP3在家蚕幼虫阶段主要存在于血淋巴中,化蛹时转运至脂肪体中,在羽化前逐渐被降解。BmSP3基因的转录及蛋白质合成、转运特征与BmSP2极为相似。; 李建伟王阿蓉李懿黎治浪龚竞侯勇夏庆友; 关键词：家蚕基因克隆

家蚕核型多角体病毒egt基因的原核表达及侵染BmE细胞中的EGT蛋白检测: 2013年; 杆状病毒的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ecdysteroid UDP glucosyltransferase,EGT)能使宿主昆虫体内的蜕皮激素失去活性而延迟蜕皮和化蛹,以利于病毒大量繁殖。从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组DNA中扩增获得egt基因全长序列片段,利用原核表达载体pET28a在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测发现EGT蛋白以包涵体形式表达,并且在16℃条件下以0.4 mmol/L IPTG诱导20 h目的蛋白质的表达量最高。采用镍柱亲和层析和切胶回收的方法获得纯化的EGT蛋白,并制备兔源多克隆抗体,其效价>5.12×105。Western blotting检测发现BmNPV侵染BmE细胞后48 h开始有EGT蛋白合成,并一直持续到144 h细胞基本死亡时还存在大量的EGT蛋白。这些结果为进一步研究BmNPV与宿主的相互作用机制提供了一定的线索,也暗示可以利用EGT蛋白调控家蚕蜕皮激素含量,使开发"永久蛹"成为可能。; 刘红玲林英杨从文张梅朱传民孙晛夏庆友; 关键词：家蚕核型多角体病毒原核表达免疫印迹分析

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析被引量：1: 2015年; 【目的】黑腹果蝇Drosophila melanogaster雌激素相关受体（estrogen-related receptor,ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR基因（Bm ERR）的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析,并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆Bm ERR基因的全长c DNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】Bm ERR基因全长c DNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示Bm ERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量RT-PCR检测表明,Bm ERR在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR c DNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。; 沈关望胡诗圆王勇吴金鑫林英夏庆友; 关键词：家蚕雌激素相关受体克隆表达谱

家蚕化蛹初期血液中卵黄原蛋白BmVg的纯化和鉴定被引量：1: 2014年; 卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)是昆虫血液中发现最早的蛋白质,对于昆虫的繁殖至关重要。以家蚕Vg基因(BmVg)的部分序列构建原核表达载体,转化E.coil BL21(DE3)菌株,在20℃条件下用0.6 mmol/L IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化得到家蚕卵黄原蛋白BmVg的肽蛋白。以BmVg肽蛋白为抗原制备的兔源多克隆抗体效价>1∶512 000。采用硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析的纯化方法,从家蚕化蛹初期的血液中纯化获得天然的BmVg蛋白,并用制备的多克隆抗体进行Western blotting检测,鉴定此纯化的天然蛋白质为BmVg蛋白。建立的BmVg分离纯化技术将有助于进一步研究BmVg的合成、转运及利用机制。; 罗娟彭芷昕陈恩祥刘红玲杨从文沈关望张海燕侯勇林英夏庆友; 关键词：家蚕卵黄原蛋白原核表达分离纯化免疫印迹法

家蚕卵黄原蛋白(BmVg)基因启动子的克隆与活性鉴定: 2014年; 卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)在家蚕蛹期脂肪体高量表达,研究家蚕卵黄原蛋白基因(BmVg)的转录调控机制及启动子活性,将有助于利用家蚕蛹生物反应器高效表达外源蛋白。设计特异引物,以家蚕蛹基因组DNA为模板PCR扩增得到BmVg长约1.5 kb的启动子片段。构建由不同长度截短BmVg启动子片段驱动荧光素酶报告基因表达的细胞转染载体pGL3-Vg Promoter,分析转染家蚕胚胎培养细胞BmE-SWU1中的BmVg启动子片段活性,结果显示最低截短至BmVg基因翻译起始位点上游90 bp的启动子片段具有转录活性。进一步用截短法分析不同长度启动子的活性,当启动子-752^-952 bp、-42^-152 bp区域被截掉后,启动子的转录活性明显降低,暗示这2个区域内可能存在与启动子启动效率相关的重要调控元件。; 杨从文沈关望张海燕彭芷昕陈恩祥邢润苗刘红玲韩超珊林英; 关键词：启动子克隆家蚕蛹

昆虫中存在高等动物性激素吗？被引量：2: 2014年; 性激素在调控高等动物附性器官的发育和成熟,激发和维持第二性征以及增进两性细胞的结合和孕育能力等方面有不可替代的作用。性激素包括雌性激素和雄性激素,主要存在于哺乳动物中。随着检测技术的不断进步,越来越多的研究显示性激素并非高等动物所特有。包括一些昆虫在内的无脊椎动物中同样含有性激素,家蚕Bombyx mori、欧洲兔虱Spilopsyllus cuniculi等昆虫被高等动物性激素或者性激素类似物处理过后能产生一定的应答,且有研究报道昆虫中同样含有羟基固醇脱氢酶等高等动物催化合成性激素的某些酶类。本文以雌激素为例,在全面总结高等动物雌激素在昆虫中的鉴定、代谢、生理作用等相关研究的基础上,分析昆虫对高等动物性激素的合成、应答以及高等动物性激素在昆虫中作为昆虫"性激素"的可能性。雌激素作为高等动物的主要雌性激素,在很多昆虫组织或个体提取物中同样存在。目前的研究已经证实家蚕等昆虫能代谢雌激素,用雌激素处理某些昆虫后也能影响该昆虫的生理过程。雌激素对高等动物许多生理过程都具有显著的调节作用,但主要还是作为性激素调节性别相关的生理过程。为了明确脊椎动物雌激素在昆虫中是否存在且发挥着性激素功能,相关的研究可以主要从3个方面着手:(1)昆虫中能否检测到高等动物雌激素类似物存在;(2)雌激素是否也能让昆虫产生雌性相关的生理应答,从昆虫中提取的雌激素类似物能否令高等动物产生雌性特异的响应;(3)昆虫是否能够合成雌激素,体内是否存在参与催化合成雌激素的酶类。; 沈关望王继岩杨从文张海燕邢润苗林英夏庆友; 关键词：性激素雌二醇昆虫生理作用生物合成

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国家自然科学基金(31101768)

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