国家教育部博士点基金(200405422001) 作品数:15 被引量:74 H指数:7 相关作者: 刘少军 刘筠 张纯 陶敏 段巍 更多>> 相关机构: 湖南师范大学 更多>> 发文基金: 国家教育部博士点基金 国家自然科学基金 国家重点基础研究发展计划 更多>> 相关领域: 生物学 农业科学 更多>>
异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析 被引量:5 2007年 细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4kb和2.1kb的片段.测序及比对分析表明:这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT-AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明:无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1025bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明:对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异. 刘良国 陶敏 段巍 刘少军 刘东 刘筠关键词:异源四倍体鲫鲤 内含子 不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆及其表达分析 被引量:5 2007年 酵母菌Dmc1(disrupted meioticc DNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因,其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的.根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物,分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpioL.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列.通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长,其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375bp,三倍体湘云鲫Dmc1全长1383bp,异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379bp,这5种鱼各自都编码342个氨基酸.结果表明,红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%,说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性;而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为86%,86%和95%.以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析.RT-PCR结果表明,Dmc1只在性腺中表达,在其他组织中不表达;通过实时荧光定量PCR(real-time PCR),对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫,三倍体湘云鲫,四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析,发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异,在卵巢和精巢均表现为:三倍体表达最高,二倍体次之,四倍体的表达最弱,特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达.同时,对这3种鱼的性腺进行组织切片分析,发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好,且四倍体成熟度高于二倍体,而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟,特别是卵巢的发育相当不好.由此可见,在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因,其表达与倍性无显著的相关性,而与性成熟相关;并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关. 陶敏 刘少军 龙昱 曾琛 刘季芳 刘良国 张纯 段巍 刘筠关键词:二倍体 三倍体 四倍体 性腺发育 新型高背型鲫鱼的形成及其生物学特征研究 被引量:8 2008年 利用鱼类远缘杂交技术和雌核发育方法获得了新型四倍体鲫鲤(G1×AT).在G1×AT中发现2%的高背型个体,其自交后代性状发生分离并形成3种两性可育的二倍体鱼:高背型红鲫、高背型双尾金鱼和青灰色鲤鱼.其中高背型红鲫自交,后代性状继续发生分离,形成高背型红鲫、花鲫和青鲫.本文主要对这3种高背型鲫鱼及其自交后代的外形特征、染色体数目、性腺显微和超微结构以及繁殖力等方面进行了研究.结果表明:(ⅰ)这3种高背型鲫鱼在外形上都具有体背高、尾柄短、头部小的优良特性.高背型红鲫、花鲫和青鲫的体高/体长值分别为0.54,0.51和0.54,三者明显高于普通红鲫的体高/体长值0.41(P<0.01);(ⅱ)3种高背型鲫鱼染色体数目与普通红鲫染色体数目一致,都为2n=100;(ⅲ)这3种高背型鲫鱼都具有正常的卵巢和精巢,它们分别能产生成熟的卵子和精子,为二倍体高背型鲫鱼品系的形成奠定了基础;(ⅳ)与普通红鲫相比,3种高背型鲫鱼具有产卵(产精)量大、繁殖期长、受精率和孵化率高等优点.它们通过自交培育出了具有高背特征的二倍体鲫鱼群体;(ⅴ)3种高背型鲫鱼既具有较高的观赏和食用价值,也可以作为优良的二倍体亲本与四倍体鱼交配来制备高背型三倍体鲫鱼.这3种高背型鲫鱼的形成在生物进化研究和鱼类遗传育种研究方面都具有重要意义. 王静 覃钦博 陈松 刘少军 段巍 刘锦辉 张纯 罗凯坤 肖俊 刘筠关键词:染色体 双头鱼的显微结构观察 被引量:1 2007年 在鲫鲤F2(红鲫(♀)×鲤鱼(♂))中,发现8尾双头畸形鱼.对这8尾双头鱼的胚胎发育、外形特征、存活时间及他们的显微结构进行了观察.结果表明:8尾双头鱼的共同特征是具有明显的两个头,两个心脏.其中7尾双头鱼为两个头部,一个身体;另1尾为两个头部,两个身体.组织学切片观察发现双头鱼头部发育正常,其中两对眼睛中可见正常发育的视杯、晶状体、角膜等结构;脑中可见两个明显分界的大脑;两个心脏具有正常的围心腔;腮裂、鳔和肠管等也发育良好.但所有双头鱼在出膜后10天左右开始相继死亡,死亡的原因与随着生长发育进程的进行,两个头部器官在内部生理和外部水环境中都存在相应的困难有关系.此外,鲫鲤F2中多尾双头鱼的形成与它们是属间的远缘杂交后代有关,亲缘关系较远的染色体之间的互作导致基因表达异常,导致出现较高比例的异常胚胎. 龙昱 刘少军 申佳珉 陶敏 肖俊 刘筠关键词:显微结构 不同倍性鱼垂体细胞和超微结构比较 被引量:8 2006年 对繁殖季节和繁殖季节后的二倍体红鲫(Carassius auratus red vat.)、三倍体湘云鲫以及四倍体鲫鲤脑垂体细胞的显微和超微结构以及组织化学特性进行了比较研究.结果表明,3种鱼脑垂体中都存在6种不同类型分泌细胞,但是不同倍性鱼的垂体细胞大小存在明显差异,就同一类细胞体积而言,四倍体鱼垂体细胞大于三倍体垂体细胞,三倍体垂体细胞大于二倍体垂体细胞.在繁殖季节,四倍体鲫鲤中腺垂体的GTH细胞所占比例最大,其次是二倍体红鲫,最少的是三倍体湘云鲫,该现象与四倍体鲫鲤的性腺发育提前、三倍体湘云鲫不育有关联;另一方面,三倍体湘云鲫中腺垂体中STH细胞所占比例最高,其次是二倍体,最少的是四倍体鲫鲤,这与三倍体湘云鲫生长速度最快、四倍体鲫鲤生长速度相对缓慢有关.另外,三倍体湘云鲫中腺垂体GTH细胞中的分泌颗粒和分泌小球在繁殖季节没有大量排出,而四倍体鲫鲤和二倍体红鲫明显有大量排出,说明三倍体湘云鲫的不育性与GTH中的激素不排出有关.以上结果说明,不同倍性鱼类在垂体结构方面表现出的差异与它们的生长速度、性腺发育等方面具有关联性. 龙昱 刘少军 黄卫人 张剑 孙远东 张纯 陈松 刘锦辉 刘筠关键词:二倍体 三倍体 四倍体 脑垂体 用团头鲂精子诱导红鲫雌核发育的研究 被引量:6 2006年 用遗传失活的团头鲂(Megalobrama amblycephala)的精子诱导红鲫(Carassius auratus Red Variety)进行雌核发育的研究,红鲫的卵子经适宜UV剂量灭活处理的团头鲂精子激活后,在0—4℃下冷休克40min抑制第二极体的排出使染色体加倍,获得雌核发育红鲫,它们的受精率、孵化率及成活率分别为(52.6±3.0)%,(23.6±4.1)%和(15.7±3.4)%,其成活率明显高于用鲤鱼精子诱导红鲫雌核发育的成活率(11.3±2.2)%.以外形特征、染色体数目及性腺发育程度为依据对雌核发育红鲫与对照杂交鱼进行了区分和鉴定,结果表明,Ⅰ龄鱼的体色为红色,染色体数目为100,性腺发育正常的个体为成功的雌核发育红鲫;而染色体数目为124或148,性腺发育滞后的个体为杂交鱼,其中三倍体鲫鲂是不育的(2年观察证明),而四倍体鲫鲂2年才能达到性成熟.以鲤鱼的精子作为对照,着重讨论了团头鲂精子作为刺激源的优势,即能提高雌核发育鱼的成活率,并可简化对雌核发育鱼的鉴定,研究证明团头鲂的精子是一种非常有效的诱导鲫鱼进行雌核发育的刺激源。 孙远东 陶敏 刘少军 张纯 段巍 申佳珉 王静 曾琛 龙昱 刘筠关键词:团头鲂 红鲫 雌核发育 四倍体 三倍体 用雄核发育方法制备改良异源四倍体鲫鲤群体 被引量:8 2007年 用UV照射金鱼的卵子使其卵核的遗传物质失活,再与异源四倍体鲫鲤(AT)产生的二倍体精子受精,在无雄核染色体加倍处理情况下,成功地获得了两性可育的二倍体雄核发育鱼(A0).Ⅱ龄性成熟的A0自交形成了雄核发育鱼自交子一代(A1).本研究对10月龄A1的染色体数目、性腺的显微和亚显微结构以及外型特征进行了观察,实验结果表明:(ⅰ)A1中包含有四倍体(A1-4n)、三倍体(A1-3n)以及二倍体后代(A1-2n),他们所占比例分别为85%,10%和5%,其染色体数目分别为4n=200,3n=150和2n=100.其中四倍体和三倍体的形成证明二倍体A0能产生二倍体配子.二倍体雄核发育鲫鲤杂交鱼产生二倍体配子的原因与早期生殖细胞的核内复制机制有关.(ⅱ)A1-4n的性腺为两性型且发育正常.其中雄性个体能挤出白色精液,其中的二倍体精子头部明显比红鲫的单倍体精子头部大.这些二倍体精子具有正常结构,由头部和尾部组成,头部与尾部交接处有多个线粒体,精子尾巴的中央轴有典型的"9+2"微管结构.A1-4n雌性个体的卵巢发育饱满,其中含有大量Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ时相的卵母细胞.在Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上能观察到受精孔.同时期的A1-2n,A1-3n的性腺发育异常,均表现为不育.A1-2n的不育性与其为远源杂交二倍体有关,A1-3n的不育性与其为远源杂交三倍体有关.(ⅲ)与AT相比,A1-4n不仅具有生长速度快、抗逆性强的优点,而且在外型上具有体背高、尾柄短、头部小等优良性状.本实验说明运用雄核发育技术不仅能获得两性可育的四倍体鱼,而且能对异源四倍体鲫鲤进行有效的遗传改良,这在细胞遗传研究和鱼类育种方面都具有重要意义. 段巍 覃钦博 陈松 刘少军 王静 张纯 孙远东 刘筠关键词:异源四倍体鲫鲤 雄核发育 新型三倍体鲫鱼肌肉营养成分和氨基酸组成分析 被引量:9 2006年 运用生物化学方法对新型三倍体鲫鱼及其父本异源四倍体鲫鲤和母本金鱼肌肉中的营养成分和氨基酸含量进行了定量分析.结果表明:新型三倍体鲫鱼肌肉中[干样(mg/g)]氨基酸总含量为102.35,人体必需氨基酸(EAA)(Thr,Val,Met,Ile,Leu,Phe,Lys,Trp)含量为45.20,占氨基酸总含量的44.16%;两种人体半必需氨基酸(HEAA)(His,Arg)含量为11.68,占氨基酸总含量的11.41%;4种呈鲜、甜味氨基酸(Asp,Glu,Gly,Ala)的含量为31.56,占氨基酸总含量的30.84%.通过对比新型三倍体鲫鱼与其父本四倍体鲫鲤、母本金鱼及其他种类鱼的肌肉营养成分,发现4种呈味氨基酸含量远远高于其父母本中相应4种氨基酸含量,人体必需氨基酸含量也远远高于湘云鲫(鲤)等其他同类品种鱼类的含量. 向兵 刘少军 张纯 孙远东 段巍 申佳珉 罗凯坤 陶敏 曾琛 刘筠关键词:金鱼 氨基酸 用团头鲂精子诱导金鱼雌核发育研究 被引量:11 2009年 用紫外灭活的团头鲂(Megalobrama amblycephala)精子激活金鱼(Carassius auratus Goldfish)卵子,用0—4℃冷水冷休克处理卵子使其染色体加倍,得到成活的雌核发育金鱼。使用与金鱼不同亚科的团头鲂精子作为激活源能极大提高雌核发育后代的鉴定效率,只需依据外形特征、染色体数目和性腺发育程度,就能容易地将雌核发育金鱼和与团头鲂杂交后代区分开。雌核发育金鱼有两种体色不同的后代,但都为双尾,体形似金鱼,染色体数目为2n=100,全雌,性腺发育正常;而杂交后代为单尾,体形似鲫鱼,染色体数目为3n=124,性腺发育滞后。本实验为证明金鱼的性别决定方式为XX/XY型提供了细胞遗传学证据。得到两种体色皆不同于母本体色的后代,可能是基因座位纯化导致后代性状分化,也可能是异精效应导致。 肖俊 彭德姣 段巍 刘少军 孙远东 龙昱 申佳珉 张纯 陶敏 刘筠关键词:金鱼 团头鲂 人工雌核发育 性别决定 异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析 被引量:2 2007年 参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列设计简并引物,扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫(Carassius carassiusred var.)和鲤鱼(Cyprinus carpioL.)的Sox基因.对不同片段大小的Sox基因测序,结果表明,四倍体鱼中存在两个Sox9基因(Atsox9a和Atsox9b),红鲫和鲤鱼中只发现一个Sox9基因(Rcsox9a和Ccsox9b).这4个Sox9基因在HMG盒中均含有内含子,大小分别为413bp,703bp,401bp和714bp,其插入位点遵守GT-AG法则.其中Atsox9a与Rcsox9a,Atsox9b与Ccsox9b的内含子序列都具有很高的一致性,分别为94.4%和97.8%,这表明内含子序列变异率较低.有趣的是,根据它们的外显子所推导的氨基酸序列一致性均为100%.因此,四倍体鱼及其原始亲本Sox9基因HMG基序内含子不仅具有长度多态性,而且内含子之间存在遗传变异性,这为进一步探讨异源四倍体鲫鲤的起源和进化提供了重要的分子生物学证据,同时也为正确掌握内含子的位置信息,功能和进化起源有着十分重要的作用. 刘季芳 刘少军 陶敏 李伟 刘筠关键词:SOX9 内含子 系统发育