广东省自然科学基金(021853)
- 作品数：7 被引量：47H指数：5
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- 相关机构：中山大学附属第二医院中山大学广州医学院第三附属医院更多>>
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- 骨髓间充质干细胞的分离培养及在精原细胞培养条件下生物学特征的观察被引量：12
- 2005年
- 目的体外分离、培养、纯化小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并观察MSCs在精原细胞培养条件下的生物学特征,为体内诱导MSCs分化为精原细胞奠定基础。方法①分离5～6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs;②通过动态观察、苏木精伊红(HE)染色、透射电镜观察、免疫组化检测细胞表面标记等鉴定MSCs;③用ELISA法检测MSCs培养上清中白细胞介素6(IL6)、IL8、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子的相对含量,与相应对照组比较;④取第3代MSCs,分组进行诱导培养观察,对照组用基本培养液培养MSCs,实验组用条件培养液诱导培养MSCs。通过显微镜下动态观察、HE染色、免疫组化等方法观察诱导结果。结果①获得纯化的MSCs;②动态观察培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,HE染色细胞呈梭形,透射电镜观察细胞较幼稚,免疫组化检测细胞表面标记CD44、CD90呈阳性,从而鉴定了MSCs;③MSCs培养上清中IL6、IL8、G CSF、SCF等的含量显著高于对照组(P<0.05);④实验组细胞形态发生变化,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阳性;对照组细胞形态不变,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阴性。结论①用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法可获得纯化的MSCs;
- 刘风华杨冬梓王沂峰梁晓萍彭文明曹长安陈系古郭忠敏
- 关键词：骨髓间充质干细胞细胞培养精原细胞生物学特征
- 原癌基因c-kit在免疫性生精障碍模型中的表达研究
- 2007年
- 目的:探讨原癌基因c-kit在免疫性生精障碍模型中的表达及意义。方法:建立免疫性生精障碍模型,在建模过程中对模型进行分析:在第1次给予抗原注射后1,2,3,4,6,8周各取1组小鼠的睾丸组织,用RT-PCR检测其c-kit mRNA的变化,用免疫组化法检测其蛋白的变化。结果:在第1次给予抗原注射后第1周开始c-kit mRNA转录水平开始降低,第2周起明显低于对照组(P<0.05),至第3,4周降至最低,第6周逐渐开始恢复,至第8周其水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果提示随着建模时间的推移,管腔内c-kit阳性细胞的数目有减少的趋势。结论:c-kit基因与生精功能密切相关,c-kit基因的低表达可能参与免疫性生精障碍导致不育的发病机制。
- 谷保霞杨冬梓王文军陈系古莫亚琴
- 关键词：RT-PCR免疫组化
- BALB/c鼠自身免疫性睾丸炎动物模型的制作被引量：9
- 2006年
- 【目的】探讨BALB/c鼠睾丸炎动物模型的建立方法,观察睾丸炎形成后到生殖功能恢复的时间间隔,以及该动物模型的稳定性。【方法】BALB/c小鼠(10周)背脊皮下注射睾丸混悬液0.1mL,浓度2×107/mL,1次/周,共4次。同种睾丸混悬液(组1)、同种睾丸混悬液加完全免疫佐剂(组2)、异种睾丸混悬液(组3)、异种睾丸混悬液加完全免疫佐剂(组4)、空白对照(组5)。【结果】组3建模成功率80%,第5、8、11周按Johusen评分为5.2±1.44、6.2±0.79、8.1±0.87,组1、2、5评分均在9.0以上,组3生精功能明显降低(P<0.05)。组4小鼠于第2次注射后3～5d,全部死亡。组3第5周生精上皮细胞减少至2￣3层,曲细精管管腔中有稀疏的精子,间质出现水肿,淋巴细胞浸润约10%￣25%。第5周组3附睾尾精子浓度为(11.0±6.2)×106,精子存活率(10.73±8.14)%,精子活动率(7.3±6.1)%,明显低于组1、2、5(P<0.05),于第11周组3恢复至正常水平。睾丸炎生精障碍持续21￣28d。【结论】异种小鼠生殖细胞可诱导建立BALB/c小鼠的EAO模型,模型有一定的持续稳定性,可用于精子发育生物学研究。
- 王文军陈系古杨冬梓谷保霞张清学洪顺家
- 关键词：自身免疫性睾丸炎动物模型精子发生病理精液分析
- 骨髓间充质干细胞向“类精子”分化的动物实验鉴定被引量：12
- 2007年
- 目的：鉴定骨髓间充质干细胞（MSCs）异体移植后是否分化为“类精子”。方法：①制作睾丸去势的动物模型：取4周龄雄性白色BALB／c小鼠40只，用环磷酰胺腹腔注射法制作睾丸绝育的动物模型，随机分成实验组和对照组各20只；②制备种子细胞（MSCs）：取5-6周龄雄性灰色129小鼠10只，以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs。待细胞生长至数量足够多时，用生理盐水制备成浓度为1×10^6／ml的细胞悬液；③异种系小鼠MSCs睾丸异体移植：实验组用盲打法给每只小鼠睾丸注射上述制备的129小鼠的MSCs悬液。对照组睾丸注射生理盐水；④移植后的观察：另取8～10周龄雌性白色BALB／c小鼠40只，分别与实验组和对照组的40只雄性小鼠按雌雄1：1合笼，观察雌鼠受孕情况。结果t实验组：有8只雌鼠分别于合笼后31—46（平均38．5）d怀孕，受孕率为40％，产下的小鼠皆为白色。对照组：1只雌鼠怀孕，受孕率为5％，产下的小鼠为白色。子代鼠皆为白色，提示129小鼠的MSCs未能分化为有功能的“类精子”，使BALB／c小鼠的子代携带129小鼠的基因而呈现预想中的黑白相间的“花色”。两组受孕率差异有显著性（P〈0．05），提示MSCs对睾丸损伤有促进愈合作用。结论：异品系的MSCs睾丸移植后未能分化为有功能的“类精子”，但对睾丸损伤有促进愈合作用。
- 刘风华杨冬梓王沂峰梁晓萍彭文明曹长安陈系古郭忠敏
- 关键词：骨髓间充质干细胞细胞培养细胞分化小鼠
- 原癌基因c-kit mRNA在自身免疫性睾丸炎中的表达及意义被引量：1
- 2006年
- 【目的】探讨原癌基因c-kitmRNA在自身免疫性睾丸炎中的表达及意义。【方法】建立并分析自身免疫性睾丸炎动物模型:42只BALB/c小鼠随机分为6个实验组和1个对照组。6个实验组小鼠分别给予KM小鼠睾丸混悬液皮下注射,每周1次最多者4次,在第1次给予抗原注射后1,2,3,4,6,8周各取一组小鼠的睾丸组织,用RT-PCR检测其c-kitmRNA的变化。【结果】在第1次给予抗原注射后第1周开始c-kitmRNA转录水平开始降低,第2周起明显低于对照组(P<0.05),至第3,4周降至最低,第6周逐渐开始恢复,至第8周其水平与对照组相比差异已经没有统计学意义(P>0.05)。【结论】c-kit基因与生精功能密切相关,c-kit基因mRNA的低表达可能参与自身免疫性睾丸炎导致不育的发病机制。
- 谷保霞杨冬梓王文军陈系古莫亚勤崔光辉
- 关键词：自身免疫性睾丸炎RT-PCR
- 睾丸性不育动物模型的建立被引量：16
- 2007年
- 目的:探讨制作睾丸性不育动物模型的方法。方法:①X-射线局部照射:取8～10周龄的BALB/c雄鼠70只,分实验组1、2、3、4、5、6和对照组各10只。实验组1、2、3、4、5、6分别用1000、1200、1400、1600、1800、2000cGy6种不同的剂量照射睾丸局部10min;对照组不做任何处理。做受孕试验。②环磷酰胺腹腔注射:取4～5周龄的雄鼠40只,分实验组1、2、3和对照组各10只。实验组分别以30、5070mg/kg体重剂量的环磷酰胺腹腔注射,每周2次,连续注射5周;对照组腹腔注射生理盐水。做受孕试验。③达菲林腹腔注射:取8～10周龄的雄鼠20只,分实验组和对照组各10只。实验组腹腔注射0.375mg/ml达菲林0.4m,l对照组腹腔注射生理盐水0.4ml。做受孕试验。④通过脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化等病理学检查鉴定。未使雌鼠受孕的雄性小鼠定为睾丸性不育,共30只。结果:①X-射线局部照射:实验组1、2的雄鼠分别于X-射线照射后10、15d使雌鼠受孕;实验组3、4的雄鼠,经观察3个月也未能使雌鼠受孕;实验组5、6的雄鼠,于X-射线照射后第5d和第2d死亡;对照组雄鼠皆于3d内使雌鼠受孕。②环磷酰胺腹腔注射:实验组1雄鼠体重增加7g左右,停药后9～14d恢复生育能力,使雌鼠受孕;实验组2雄鼠体重增加4g左右,停药后观察3个月未使雌鼠受孕;实验组3雄鼠体重不增,呈消瘦状,分别于用药第3、4、5周相继死亡;对照组雄鼠皆于3d内使雌鼠受孕。③达菲林腹腔注射:实验组雄鼠于停药后3周左右使雌鼠受孕;对照组雄鼠皆于3d内使雌鼠受孕。④TUNEL结果:对照组睾丸组织偶见凋亡细胞,占(0.71±0.12)%;睾丸性不育组睾丸组织凋亡细胞数量明显增加,占(10.36±1.48)%,两者比较差异有显著性(P<0.05)。HE染色:对照组睾丸组织正常,生精小管呈饱满椭圆形,各级生精细胞排列有序,内含大量精子�
- 刘风华杨冬梓王沂峰梁晓萍彭文明曹长安陈系古郭忠敏
- 关键词：动物模型
- 小鼠骨髓间充质干细胞移植异体睾丸的研究被引量：5
- 2005年
- 目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植异体睾丸.方法:①分离5～6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,用Percoll密度梯度离心法和贴壁法分离、培养、纯化MSCs.②取第3代MSCs,用Hoe-chest33342标记并观察,制备细胞悬液.③用睾丸网注射法将标记的MSCs移植入异体小鼠睾丸内,于各时相点取睾丸组织,在3个位点连续制作快速冰冻切片,镜下观察.结果:①传至3代即可得到数量较多的纯化的MSCs.②在荧光显微镜下,标记的MSCs细胞核呈亮黄色.③用睾丸网注射法行小鼠MSCs移植异体睾丸成功,未见免疫排斥反应发生.移植后1、3 d,只在中间的切片上见到MSCs,细胞核呈亮黄色,两侧的切片未查到MSCs,移植后1 d细胞较集中,移植后3 d细胞散在分布;移植后6、9、12 d,3个位点的切片均见MSCs,部分MSCs排列呈管状;移植后15、18 d,MSCs的核荧光有所减弱;移植后21 d,荧光消失.结论:用睾丸网注射法将小鼠MSCs移植异体睾丸获得成功,未见免疫排斥反应发生,移植后的MSCs存活.
- 刘风华杨冬梓王沂峰梁晓萍彭文明曹长安黎青马芸陈系古郭忠敏
- 关键词：骨髓间充质干细胞睾丸异体移植
