重庆市自然科学基金(CSTC2007BB5301)
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- 靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定
- 2010年
- 目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体。方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照。结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符。结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gsα蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础。
- 田运娇易岂建米青李娅莎
- 关键词：RNA干扰质粒心力衰竭
- RNAi选择性下调大鼠心肌细胞上Gsα蛋白的体外实验
- 2010年
- 目的:用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)选择性下调大鼠心肌细胞上乌苷酸结合蛋白(Gs)α亚基(Gs protein alphala subunit,Gsα)的表达,筛选出抑制Gsα蛋白效果最明显的特异短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒。方法:构建3条靶向gnas基因的特异与RNA质粒载体(shRNA1-3),以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体为阴性对照(HK),用脂质体LipofectamineTMLTX&PLUS转染原代培养的大鼠心肌细胞,并设空白对照组,转染后通过半定量RT-PCR和Western blot法检测GsαmRNA和蛋白的表达情况,以内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)进行标化。结果:shRNA1-3均使Gsα的mRNA和蛋白质表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),且shRNA3的抑制效果最显著,阴性对照质粒组与空白对照组Gsα表达差异无统计学意义。结论:利用RNAi技术成功下调了原代培养的心肌细胞中Gsα的表达,并筛选出沉默效果最明显的shRNA真核表达质粒,为心肌细胞的转染提供了可行的方法。
- 田运娇易岂建米青刘官信李娅莎
- 关键词：心肌细胞RNA干扰
