教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-05-0752)
- 作品数：5 被引量：38H指数：3
- 相关作者：冯家勋段承杰唐纪良刘利封毅更多>>
- 相关机构：广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室贺州学院更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家自然科学基金广西壮族自治区科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性被引量：6
- 2008年
- 从水牛瘤胃内容物的添加滤纸为碳源的富集培养物中提取未培养微生物的总DNA,以柯斯质粒为载体构建了1个含约8000个克隆的宏基因组文库,对文库进行活性筛选获得1个既表达CMCase活性又表达4-MUCase酶活性的克隆。亚克隆及测序分析发现1个潜在的可编码333个氨基酸的ORF(Open Reading Frame),其蛋白质产物与1个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶Cel A的同源性最高,两者的一致性为53%,相似性为68%。将PCR扩增的该基因完整的ORF克隆入表达载体pET30a(+),在大肠杆菌中得到其过量表达产物。经过Ni-NTA纯化后,该表达产物(Umcel5K)具有CMCase活性和4-MUCase酶活性,其最适pH是4.5~5.0,最适温度是50°C。pH耐受性检测表明,该酶在pH4~4.5比较稳定。温度耐受性实验表明该酶不耐高温,在55°C以下比较稳定。经过镍柱纯化的酶液比活为26.15 U/mg。部分金属离子如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活,而另外一些金属离子如K+、Li+等对Umcel5K的活性影响不大。
- 谭婉新刘利胡亚林段承杰唐纪良冯家勋
- 关键词：未培养微生物宏基因组文库内切葡聚糖酶克隆
- 水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性被引量：32
- 2008年
- 以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得1.26×10~5个克隆,文库含外源DNA的总长度约为4.8×10~6 kb。从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性,其最适pH和最适温度分别为6.0～6.5和45℃。一些金属离子如Ca^(2+)、Zn^(2+)能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如Fe^(3+)、Cu^(2+)能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35℃和5 mmol/L的Ca^(2+)存在的条件下,用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。
- 郭鸿封毅莫新春段承杰唐纪良冯家勋
- 关键词：未培养微生物宏基因组Β-葡萄糖苷酶
- 结晶纤维素降解细菌的筛选、分离与鉴定被引量：2
- 2008年
- 采用以结晶纤维素(Avicel)为唯一碳源的平板活性筛选法,从60份森林腐殖土、腐木样品中分离得到2株在pH 5.0、37℃条件下高效降解结晶纤维素的细菌菌株GXN152和GXN153。以菌株的总DNA基因为模板,用细菌的16S rRNA基因的通用引物扩增得到菌株GXN152和GXN153的16S rRNA基因序列。测序分析表明菌株GXN152的16S rRNA基因序列和洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)菌株CNR22的16S rRNA基因序列的同源性最高,具有98%的同源性,生理生化特性检测表明菌株GXN152具有洋葱假单胞菌的鉴别特征,将结晶纤维素降解菌GXN152鉴定为洋葱假单胞菌。菌株GXN153的16S rRNA基因序列和类芽孢杆菌(Paenibacillus favisporus)菌株GMP01的16S rRNA基因序列的同源性最高,具有99%的同源性,生理生化特性检测表明菌株GXN153具有类芽孢杆菌的鉴别特征,将纤维素降解菌GXN153鉴定为类芽孢杆菌。
- 陈春岚庞浩唐纪良冯家勋
- 关键词：降解细菌
- 纤维糊精酶DM1与CBD的融合及融合酶性质分析被引量：1
- 2008年
- 纤维糊精酶(cellodextrinase)属纤维素酶类中的一类,可以从短链纤维素分子上水解糖苷键生成葡萄糖或纤维二糖。曾克隆了纤维糊精酶DM1的编码基因,该酶与生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的Cellodextrinase A的一致性为52%。通过人工合成基因的方法合成了细菌来源的3个分别为家族_4_9(GenBank索引号为AAA73869)、家族Ⅲc(GenBank索引号为BABB33148)和家族10(GenBank索引号为CAA60493)的纤维素结合功能域(CBD)和连接桥(linker)的DNA序列。通过把编码纤维糊精酶DM1(GenBank索引号为ACA61162)的催化功能域(CD)的DNA序列与合成的CBD和连接桥的DNA序列进行融合,构建了3个融合酶,并分别在大肠杆菌BL21中得到过量表达。纤维素结合实验表明,3个纯化的融合酶对结晶纤维素(Avicel)和滤纸粉末均有结合能力,融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc与结晶纤维素(Avicel)结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为58.60%、51.16%和21.13%,与滤纸粉末结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为65.59%、60.47%和22.54%,证实与原始酶相比3个融合酶的CBD均有纤维素结合的功能。酶学特性研究表明,融合酶的最适pH、最适温度、pH稳定性和温度稳定性等没有显著改变,均未检测到3个融合酶有新的活性,但它们对p-nitrophenylβ-D-cellobioside(pNPC)、p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)和lichenan等底物的比活力显著降低。3个融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc对pNPC的比活力分别为原始酶DM1的26%、2%和2%,对lichenan的比活力分别为原始酶DM1的12%、8%和2%,几乎检测不到后两个融合酶对pNPG的酶活。
- 庄永红刘利段承杰唐纪良冯家勋
- 关键词：基因融合DNA合成
- 一株降解结晶纤维素细菌的分离、筛选、鉴定及其产纤维素酶特性被引量：3
- 2008年
- 从广西5个自然保护区内采集原始森林深层腐殖土壤等样品147份,采用平板活性筛选法分离得到3500多株能降解结晶纤维素的细菌,并从中筛选到一株能在pH5.0、28℃条件下可高效降解结晶纤维素的细菌菌株N9-1-1。N9-1-1产纤维素酶水解微晶纤维素和纸浆的最适pH、最适温度分别为:4.0、40℃和4.5、35℃,但对羧甲基纤维素无水解活性。该菌株所产纤维素酶比较符合纤维素同步糖化共发酵工艺生产乙醇的要求。以菌株N9-1-1的总DNA为模板,对其16S rRNA基因进行PCR扩增和序列分析,结果表明,菌株N9-1-1的16S rRNA基因序列和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的同源性最高,为99%。形态特征观察和生理生化检测结果表明,菌株N9-1-1具有粘质沙雷氏菌的鉴别性特征。因此,将N9-1-1鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
- 刘果张政段承杰冯家勋
- 关键词：粘质沙雷氏菌纤维素酶
