国家自然科学基金(30470829)
- 作品数：24 被引量：46H指数：4
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- 相关机构：南方医科大学广州市中医医院暨南大学更多>>
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- GILZ真核表达载体的构建及其表达定位被引量：1
- 2009年
- 目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZcDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。结果:HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20kD。结论:成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。
- 王毅飞邢飞跃蔡德鸿陈宏莫永炎伊娜
- 关键词：C3H10T1/2细胞真核表达载体
- 血管紧张素Ⅱ对人胰岛B细胞分泌功能的影响及氯沙坦的保护作用被引量：4
- 2007年
- 目的动态监测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对分离纯化人胰岛B细胞分泌功能的影响,探讨AngⅡ1型受体(AT1受体)阻滞剂氯沙坦(Losartan)预处理对AngⅡ致人胰岛B细胞功能损伤的保护作用及相关机制。方法2006年3月至10月,对南方医科大学附属珠江医院器官移植中心提供的成人尸体供胰进行人胰岛细胞的培养,并以AngⅡ及氯沙坦作用于分离纯化的人胰岛细胞,检测胰岛B细胞内游离Ca2+及钙调素(CaM)的波动情况;以胰岛灌流实验,绘制胰岛素动态分泌曲线。结果AngⅡ对胰岛B细胞分泌功能的影响呈先升后降双向性,AngⅡ使胰岛B细胞内游离Ca2+浓度升高,此作用可被氯沙坦所逆转。AngⅡ对细胞内CaM无明显影响。结论AngⅡ通过与胰岛B细胞表面AT1受体结合,使细胞内游离Ca2+波动,导致胰岛B细胞功能损伤,氯沙坦预处理通过抑制钙超载,保护AngⅡ致人胰岛B细胞功能损伤。
- 刘敏蔡德鸿张桦鲁辛孙嘉张振李明
- 关键词：CA^2+钙调素
- 叙利亚金黄地鼠胰岛的分离、纯化与功能鉴定
- 2009年
- 目的构建成年叙利亚金黄地鼠胰岛的分离、纯化及功能鉴定的方法。方法胶原酶V灌注分离成年叙利亚金黄地鼠胰腺,不连续密度梯度法纯化胰岛。经DTZ染色后于倒置显微镜下测定胰岛细胞的数量和纯度。通过胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果纯化后每只地鼠胰腺可获得(359±35)胰岛细胞当量,胰岛纯度>90%,胰岛活率>90%。在低糖和高糖刺激下,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量的浓度分别为(3.29±0.32)mU/L和(11.12±0.57)mU/L。高糖刺激后胰岛素释放量为低糖的3.38倍。体外培养1周生长状况良好。结论成功获取了高纯度、高活率的金黄地鼠胰岛细胞。
- 孙侃孙嘉陈宏张桦蔡德鸿
- 关键词：胰岛纯化
- 血管紧张素Ⅱ诱导RIN-m细胞凋亡的实验研究
- 2010年
- 目的:以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及AngⅡ1型受体(AT1受体)拮抗剂氯沙坦作用于RIN-m细胞(来源于射线诱导的褐鼠胰岛素细胞瘤),观察RIN-m合成及分泌胰岛素功能及细胞凋亡的情况。为进一步在临床中研究血管紧张素受体拮抗剂对糖代谢的改善作用提供实验证据。方法:细胞的培养及干预:RIN-m细胞(40～50代)接种于3mL含5.6mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液中。A组加入10μL生理盐水,B、C、D、E组加入终浓度分别为0.1、1、10及100nmol/L的AngⅡ,F组在加入100nmol/L的血管紧张素Ⅱ醋酸盐前10mim给予氯沙坦1μmol/L。各组处理后继续置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中48h。RIN-m细胞行流式细胞仪(AnnexinV/FITC)及TUNEL检测凋亡。结果:两种凋亡检测结果大致相似,TUNNEL检测各组凋亡率分别为(7.50±1.18)%,(8.15±0.97)%,(12.67±1.35)%,(15.88±1.75)%,(20.66±0.80)%,(7.74±0.84)%;流式细胞仪检测各组凋亡率分别为(7.62±0.87)%,(8.74±1.31)%,(14.64±1.48)%,(16.47±0.88)%,(20.51±1.03)%,(7.63±0.79)%。AngⅡ干预组凋亡率高于空白对照组,并呈剂量-效应依赖关系,氯沙坦预处理+AngⅡ组与空白对照组比较差异无统计学意义(P=0.98)。结论:AngⅡ可能通过与胰岛β细胞表面AT1受体结合而诱导RIN-m细胞凋亡,氯沙坦可抑制AngⅡ的促凋亡作用。
- 刘敏蔡德鸿张桦袁小澎孙佳陈宏
- 关键词：RIN-M细胞凋亡
- 胰岛局部肾素-血管紧张素系统在糖尿病及胰岛移植中的作用被引量：1
- 2006年
- 鲁辛蔡德鸿
- 关键词：血管紧张素系统胰岛移植糖尿病局部RAS促炎症反应
- 供体凋亡脾细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究被引量：3
- 2007年
- 目的探讨供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的可行性。方法应用链脲佐菌素(STZ)制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡。将糖尿病SD大鼠分为4组,分别经阴茎背静脉输注Hanks液、供体正常脾细胞、供体凋亡脾细胞、供体坏死脾细胞,7天后于肾包囊进行同种异体胰岛移植,测定血糖变化,观测胰岛移植物存活时间,并通过混合淋巴细胞反应(MLR)观察移植耐受的状态。结果预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位存活时间达31天),并使受体鼠对供体鼠的MLR明显减弱。结论供体凋亡细胞输注能够诱导同种异体大鼠胰岛移植免疫耐受。
- 陈宏张振张桦王梅蔡德鸿高毅
- 关键词：凋亡细胞胰岛移植免疫耐受糖尿病
- His-GILZ原核表达载体的构建及其表达与纯化被引量：2
- 2009年
- 目的获取糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白(GILZ)的His融合蛋白,为下阶段深入研究GILZ的结构、功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础。方法利用基因工程技术,BamHⅠ/XhoⅠ酶切真核表达质粒HA-GILZ/PcDNA3获得GILZ cDNA,重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒pET-30a中。然后用该亚克隆重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,用Ni2+-NTA柱纯化。结果亚克隆获得GILZ/pET-30a高效原核表达重组载体,诱导表达的融合蛋白占细菌总蛋白高达40%以上,纯化的蛋白分子量约为24kD。结论成功构建His-GILZ融合蛋白原核表达载体,并高效表达、纯化,为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定了基础。
- 王毅飞蔡德鸿陈宏莫永炎伊娜邢飞跃
- 关键词：融合蛋白纯化
- 供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠CD4^+CD25^+T细胞的影响
- 2009年
- 目的探讨供体凋亡细胞输注对诱导胰岛移植免疫耐受大鼠CD4^+ CD25^+T细胞的影响。方法糖尿病SD大鼠23只,随机分为4组,分别输注Hanks液(Hanks组)、供体正常脾细胞(正常细胞组)、供体坏死脾细胞(坏死细胞组)及供体凋亡脾细胞(凋亡细胞组)。输注后第7天行同种异体胰岛移植,测血糖,观测胰岛移植物存活时间,流式细胞仪检测受体大鼠CD4^+ CD25^+T细胞的比例变化。结果预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位生存时间达31天),预输注凋亡细胞组CD4^+ CD25^+T细胞比例明显高于其他各组(P均<0.05)。结论供体凋亡细胞输注能够诱导同种异体大鼠胰岛移植免疫耐受,CD4^+ CD25^+T淋巴细胞可能在其中发挥重要作用。
- 陈宏张振张桦王梅李明高毅蔡德鸿
- 关键词：凋亡细胞胰岛移植CD4^+CD25^+T细胞糖尿病
- 直线加速器照射诱导体外培养大鼠的脾细胞凋亡被引量：3
- 2007年
- 目的探讨直线加速器X线照射诱导体外培养的大鼠脾细胞凋亡的实验方法。方法无菌条件下手术摘取Wistar大鼠脾脏,制备脾细胞悬液。应用直线加速器照射诱导脾细胞凋亡,通过细胞形态学观察,流式细胞术测定大鼠脾细胞凋亡率。结果经直线加速器X线照射,吸收剂量为1.5,2.0,3.0 Gy的实验组脾细胞凋亡率分别为(43.51±4.77)%,(57.89±3.98)%,(57.42±3.33)%,与对照组(32.70±3.63)%比较,差异有显著性(P<0.05)。结论直线加速器X射线照射可以简便、安全、有效地诱导大鼠脾细胞凋亡。
- 陈宏张振张桦肖明星蔡德鸿高毅
- 关键词：WISTAR大鼠脾细胞凋亡体外培养细胞凋亡率X线照射
- 过氧化氢对胰岛微血管内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A_2表达的影响
- 2009年
- 目的:研究过氧化氢(H2O2)对胰岛内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2(iPLA2)mRNA表达的影响.方法:用0,30,100和300μmol/L H2O2诱导IMECs 8 h后进行RT-PCR检测;用300μmol/L H2O2分别诱导0,4,8和12 h后应用RT-PCR技术进行iPLA2基因表达的检测.采用Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞的凋亡率;采用DIOC6(3)染色检测细胞线粒体膜电位.结果:①300μmol/L H2O2作用12 h的电泳条带亮度与其他组(0,30,100μmol/L)相比明显减弱,300μmol/L H2O2作用8 h及12 h的电泳条带亮度与0,4 h相比明显减弱.②各浓度H2O2处理组(0,30,100和300μmol/L)IMECs凋亡率差异具有统计学意义[分别为(2.0±0.5)%,(19.1±5.8)%,(28.4±4.9)%,(40.1±5.1)%,P<0.01];300μmol/L H2O2处理0,4,8,12 h后,各时间点IMECs凋亡率差异具有统计学意义(P<0.01);③各浓度及各时间点H2O2处理组IMECs细胞内DIOC6(3)的荧光强度差异具有统计学意义(P<0.01).结论:H2O2对IMECs iPLA2的表达具有抑制作用,其抑制作用呈量效及时效关系.
- 孙嘉张桦陈宏蔡德鸿
- 关键词：过氧化氢磷脂酶A2胰岛微血管内皮细胞
